技術領域

本發明屬于基因工程。

背景技術

當前，制備轉基因動物存在一個急待解決的重要問題，就是一般采用的受精卵顯微注射法設備昂貴，操作技術復雜，效率低，生產成本高，人們在試圖尋求一種簡單、高效的轉基因方法，精子載體法受到極大的關注。

1971年Brackett等用同位素標記的SV40病毒DNA與家兔精子共卵育，首次證實精子可以作為載體進行外源基因轉移。18年后，Arezzo(1989年)用吸附pSRVCAT或pSV2CAT的海星子精子與卵子受精后，外源基因在胚胎中獲得表達。同年，Lavitrano等(1989年)用小白鼠附睪精子作為外源DNA載體，與卵子體外受精后，后代中30％是轉基因小鼠。此后，相繼在多種動物上獲得進展(1998年)。Lavitrano等又在2002年和2005年分別以人衰變加速因子(hDAF)基因及3種熒光蛋白基因作為外源DNA，培育轉基因豬獲得成功。以精子作為載體進行基因轉移制備轉基因動物方法簡便，成本低，可以達到很高的效率，對卵原核無損害，符合生理受精過程，可與人工受精結合，可在幾乎所有動物上應用，便于規模生產，前景誘人。但是，Brinster等的大量小鼠試驗卻未獲得陽性后代。精子載體法由于轉基因效率不穩定、不同作者可重復性差，難以得到實際應用。

精子載體法建立轉基因動物首先需外源DNA與精子結合，成熟的動物精子生理結構與功能上具有結合外源DNA并使其核內化的能力。精子膜上存在30-35KD的外源DNA潛在結合蛋白，外源DNA與結合蛋白特異性結合，然后進入精子細胞內。在精子生成過程中MHC-II基因的表達使精子具有結合外源DNA能力，同時也使成熟的精子頭部的CD4分子將結合的外源DNA導入細胞核內。精子結合外源DNA的量是恒定的，部分DNA(總結合DNA的15-22％)進入精子核內。外源DNA整合到細胞染色體上可能與拓樸異構酶有關，基質區的染色體在拓樸異構酶II的作用下整合外源DNA。但是動物精子存在保護自身免受外源遺傳物質侵入的生理屏障，從而確保動物在長期的進化過程中維持遺傳的可靠性和物種的穩定性。精液中存在著某些影響精子膜通透性的因子，哺乳動物精液含有一定量的核酸酶(DNase?I)能降解外源DNA分子；特別是分子量為37KD的糖基化蛋白(inhibitory?factor-1，IF-1)廣泛存在于精清中及無精清的低等動物精子表面，它與外源DNA同樣選擇性地結合到精子的核后區，可以直接作用于外源DNA分子，或與結合蛋白競爭性結合，使精子表面外源DNA結合位點失去結合外源DNA的能力。外源DNA進入精子可能引起核酸裂解酶活性增高，可將外源DNA降解，難以進入精子細胞的核內。外源DNA可能在染色體外以附加體的形式存在。受精后受精卵內外源DNA可能發生降解或者重排。

以精子載體培育轉基因動物最先采用的是直接共孵育法，對精子充分洗滌是其關鍵措施。經洗滌去除精清從而清除IF-1，消除外源DNA與精子結合的主要障礙，有利于外源DNA與精子的結合。但如上所述，該方法外源DNA與精子結合的隨機性較大，結果不穩定，可重復性差。因此，又出現了多種試圖促進外源DNA與精子結合的改進技術，主要有電穿孔法、病毒介導法、脂質體法等。電穿孔法可以提高精子對外源DNA的攜帶率，但過早引起頂體反應，使受精率明顯下降。病毒載體構建方法復雜，容納外源DNA的大小也有限，而且獲得轉基因動物嵌合體比例大，特別是因存在多種潛在危險而令人生畏。脂質體介導法利用陽離子脂質體與帶負電的DNA形成脂質體/DNA復合物，通過靜電作用被細胞吸附，進而由細胞融合或胞吞作用進入細胞，脂質體包裹DNA還可以防止胞質內核酸酶的降解及防止DNA被稀釋，從而提高外源DNA與精子的結合能力，從而相應提高制作轉基因動物的效率。但脂質體-基因體系不穩定，組織特異性較差，過量的脂質體對精子產生毒害作用。隨機性大、可重復性差的問題仍然難以得到根本改觀，外源DNA穩定地與精子結合并且不被降解整合到生殖細胞染色體上仍未有效解決，方法有待改進。