技術領域

本發明涉及一種檢測蛋白質標志物的方法，具體地說是一種利用納米金修飾的Aptamer分子建立一種靈敏度高、操作簡便的蛋白質檢測新方法。

背景技術

在人類基因組計劃完成后，生命科學面臨的最重要任務之一就是對人類基因調節與功能的注釋與確認，即進入所謂的“后基因組時代”。由于基因的功能主要通過其編碼的蛋白質來實現，蛋白質是生命活動真正的執行者，蛋白質組學被認為是后基因組研究中的最主要部分。研究疾病有關的蛋白質是蛋白質組學的重要范疇之一。通過蛋白質組研究，大量與疾病有關的蛋白質標志物被發現并用于醫療實踐。如一批腫瘤早期標志蛋白分子(Biomarker)被鑒定出來，為腫瘤的早期診斷、藥靶的發現、療效和預后的判斷提供了重要依據。由于與疾病早期發病有關的蛋白質標志物往往濃度非常低，因此研究蛋白質超靈敏檢測與定量方法，對于與疾病有關蛋白質的發現以及將其用于疾病的診斷與治療，都顯得非常重要。但是由于在發病的早期這些標志物在體液中濃度太低，而不能用通常的的ELISA或免疫印跡方法進行檢測。目前，蛋白質的檢測通常是采用基于抗體的免疫學方法，寡核苷酸適配子(Aptamer)的發現，為蛋白質的檢測提供了一個強有力的工具。Aptamer是通過指數富集配基的系統(systematic?evolution?of?ligands?by?exponential?enrichment，SELEX)篩選出來的寡核苷酸序列，其具有獨特的生物特性，如與一定的蛋白質具有與抗體一樣的高親和力，有時甚至比抗體的親和力還強，它還易于修飾，對核酸酶降解有抵抗力。這些特性使Aptamer在分析化學領域成為抗體的強大的競爭對手。當前利用Aptamer的蛋白質檢測方法，有的靈敏度不是很高，有的雖有較高靈敏度，但需要昂貴的儀器。

發明內容

本發明的任務是提供一種基于納米金修飾的Aptamer技術進行蛋白質標志物檢測的新方法，使其具有靈敏度高，檢測費用低，快速簡便，適于基層單位推廣等特點。

實現本發明的技術方案是：

以納米金(NP，nanoparticle)修飾的Aptamer與靶蛋白質結合，同時另一個生物素化的寡核苷酸適配子也結合于靶蛋白質，構成一個三明治形式的復合物，接著三明治復合物通過親和素結合于酶標板上，然后以銀染增強法來放大三明治復合物上的靶蛋白質濃度信息，強化信號的強弱與靶蛋白質濃度有關，靶蛋白質濃度越高，相同強化時間下所得的銀染信號越高，最后用比色法建立標準曲線對樣本中蛋白質濃度信息進行檢測。(見圖1)。

本發明蛋白質標志物檢測方法包括以下步驟：

(1)納米金修飾的寡核苷酸適配子Aptamer制備；

(2)親和素包被于酶標板上；

(3)靶蛋白質分子與生物素標記的適配子探針及NP修飾的適配子探針孵育構建成三明治形式的復合物；

(4)三明治復合物固定于固相載體酶標板上，洗滌去除未結合的適配子；

(5)利用銀染增強技術使因復合物結合而保留下的探針的納米金標記信號得以放大，并實時讀取吸光度值，根據保留下的納米金標記探針的量與靶蛋白的量成正比例關系的特點，采用已知濃度梯度的靶蛋白分子制定標準曲線，從而計算得出待測樣本中靶蛋白分子的含量。

本發明的具體步驟及操作方法是：

1.寡核苷酸適配子的制備

帶有巰基及生物素修飾的Aptamer由中國上海Invitrogen生物技術公司合成，序列如下：

Biotin-modified?Aptamer：(生物素修飾Aptamer)

5’-Bio-GCAGTTACTCAGGGCACTTGCAAGCAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTAT-3’)

Thiol-modified?Aptamer：(巰基修飾Aptamer)

5’-SH-(CH₂)₆-AGTTCTTACTCAGGGCACTTGCAAGCAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTAT-3’