[發明專利]納米顆粒修飾寡核苷酸適配子檢測蛋白質的方法無效
| 申請號: | 200710051878.8 | 申請日: | 2007-04-13 |
| 公開(公告)號: | CN101598734A | 公開(公告)日: | 2009-12-09 |
| 發明(設計)人: | 徐順清 | 申請(專利權)人: | 華中科技大學 |
| 主分類號: | G01N33/68 | 分類號: | G01N33/68 |
| 代理公司: | 武漢開元知識產權代理有限公司 | 代理人: | 樊 戎 |
| 地址: | 430074湖北*** | 國省代碼: | 湖北;42 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 納米 顆粒 修飾 寡核苷酸 配子 檢測 蛋白質 方法 | ||
1.一種蛋白質標志物檢測方法,包括以下步驟:
(1)制備納米金修飾的寡核苷酸適配子Aptamer;
(2)將親和素包被于酶標板上;
(3)將靶蛋白質分子與生物素標記的適配子探針及NP修飾的適配子探針孵育構建成三明治形式的復合物;
(4)將三明治復合物固定于固相載體酶標板上,洗滌去除未結合的適配子;
(5)利用銀染增強技術使因復合物結合而保留下的探針的納米金標記信號得以放大,并實時讀取吸光度值,根據保留下的納米金標記探針的量與靶蛋白的量成正比例關系的特點,采用已知濃度梯度的靶蛋白分子制定標準曲線,從而計算得出待測樣本中靶蛋白分子的含量。
2.根據權利要求1所述的蛋白質標志物檢測方法,其特征在于,以納米金修飾的寡核苷酸適配子Aptamer,即納米金通過共價鍵合作用標記在烷巰基修飾的Aptamer探針上具體方法是:通過指數富集配基的系統進化systematic?evolution?of?ligands?by?exponentialenrichment,SELEX技術篩選并合成得到兩個與靶蛋白有高度親和力、高特異性結合的Aptamer適配子,將兩個適配子的5’端延伸5個堿基后,進行巰基化和生物素修飾,取500μL納米金溶液以14,000rpm離心10min;加入50μL含300nmol/L巰基修飾探針的Tris-EDTA(pH?7.4,10mmol/L?Tris-HCL,1mmol/L?EDTA)于沉淀的納米金中,4℃保存12h;加入50μLTE緩沖液(pH=7.4,0.2mol/L?NaCl),4℃保存24h;離心,13600g,10min,棄上清,以雙蒸水洗滌,以除去多余的探針;再離心,沉淀中加入100μLTE緩沖液,混勻。
3.根據權利要求1所述的蛋白質標志物檢測方法,其特征在于,將靶蛋白質分子與生物素標記的適配子探針及納米金修飾的適配子探針孵育構建成三明治形式的復合物上的具體方法是:取10μl不同濃度的靶蛋白PDGF-BB(platelet-derived?growth?factor?B-chainhomodimer)溶液(1amol/L~10?nmol/L,含137mM?NaCl,10.1mM?Na2HPO4,pH?7.4,2.7mMKCl,1mM?MgCl2,和10g/L?BSA),加入20μl生物素標記的探針(10nM)和20μl納米金修飾的探針(8nM),在室溫下孵育20min,即得適配子-蛋白質-適配子三明治復合物;
4.根據權利要求1所述的蛋白質標志物檢測方法,其特征在于,將三明治復合物固定于固相載體上并洗滌去除未結合的適配子的具體方法是:將復合物混合液轉移到親和素包被的酶標板上,在37℃孵育30min;以1×PBS(0.2mol/L?NaCl,20mM?Na2HPO4/NaH2PO4,pH?7.0)洗滌5min,再以2×PBN(0.3mol/L?NaNO3?and?10mmol/L?Na2HPO4/NaH2PO4,pH7.0)洗兩次,每次5min;
5.根據權利要求1所述的蛋白質標志物檢測方法,其特征在于,利用銀染增強技術使納米金標記信號得以放大的具體方法是:取銀染增強液(0.5g?AgNO3/2ml?H2O,12ul,1.7g?hydroquinone/30ml?H2O,300ul,2.55g?citric?acid/2.35g?trisodium?citrate/10ml?H2O),現配現用,混勻后迅速加入各個酶標板孔內,每孔100ul,用酶標儀實時檢測銀染增強的OD值(630nm),反應一定時間,置入超純水中,終止反應,該銀增強反應在避光或弱光下進行。
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