技術領域

本發明屬于生化工程技術領域，具體涉及一種利用高活性基因工程菌生產5’-呈味核苷酸的方法。

背景技術

5’-核苷酸常被用作食品添加劑和藥物合成中間體，其中5’-肌苷酸(Inosine-5’-monophosphate，簡稱5’-IMP)和鳥苷酸(Guanosine-5’monophosphate，簡稱5’-GMP)作為一種呈味劑可與味精(谷氨酸鈉MSG)混合產生協同效應，使鮮度提高數倍至數十倍；此外它們對甜味、肉味有增效作用，對咸、酸、苦味及腥、焦味有抑制作用，因此在食品工業生產中越來越受到重視和歡迎。

工業化生產5’-核苷酸的方法主要有核糖核酸(RNA)酶解法，利用谷氨酸產生菌、產氨短桿菌、谷氨酸桿菌等微生物直接發酵法以及利用枯草桿菌、短小芽孢桿菌、產氨短桿菌等發酵肌苷后以化學法或者微生物酶法轉化為5’-肌苷酸。這些方法或者反應物對人體有毒性或者反應底物昂貴或者副產物多，所以不能用來高效而廉價的生產5’-核苷酸。

三原康博等報道了一種利用酸性磷酸酶(acidphosphatase，EC3.1.3.2)以焦磷酸鈉鹽為磷酸供體生產5’-核苷酸的方法，以突變后的基因工程菌為酶源，反應12小時IMP累積量達到120.5g/l，肌苷轉化率約76.5％。然而此方法仍然存在生產周期長，轉化率不高等缺點。

發明內容

本發明的目的是提供一種酶，一個編碼該酶的基因，含有該基因的重組DNA，可用于生產5’-呈味核苷酸的微生物；

本發明的另一目的是提供一種高效廉價生產5’-呈味核苷酸的方法。

本發明所采用的技術方案如下：

1.利用重組DNA技術，構建酸性磷酸酶表達載體，并轉化大腸桿菌(Escherichia?coli)，得到高效表達酸性磷酸酶的基因工程菌。

酸性磷酸酶的來源不做限制，只要能催化相應的核苷與磷酸基供體在酸性緩沖液中生成相應5’-核苷酸即可，例如產氣腸桿菌(Enterobacter?aerogenes)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia?carotovora)等，在特別推薦的方案中，本發明使用產氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes?W8401)的酸性磷酸酶。

構建重組質粒的載體也不做限制，只要能高效表達外源的酸性磷酸酶即可，在特別推薦的方案中，本發明使用溫度誘導型的表達載體pBV220，此載體不需使用化學誘導劑，只須提高溫度到42℃誘導4h即可誘導外源蛋白的大量表達，相對于通常所用的由化學誘導劑誘導表達的表達質粒(如攜帶由IPTG誘導的lac啟動子的質粒)而言，可以節約大量成本。

培養微生物的培養基不受特別限制，為可以獲得含有一般碳源，氮源，無機離子和可選的有機營養物質的普通培養基，在特別推薦的方案中，本發明使用的是LB培養基，配方如下：蛋白胨10g、酵母抽提物5g和NaCl10g，使用10mol/LNaOH調節pH為7.2，定容至1L。固體培養基只需在液體培養基內加入2％瓊脂即可。

培養微生物的條件也不特別限制，例如可以在需氧條件下培養12-48小時，同時將pH值控制在5-8，溫度控制在25-40℃的范圍。對于需要誘導表達外源蛋白質的微生物的培養，可以在上述的培養之后再根據相應表達載體選擇相應的誘導表達條件，例如使用pBV220表達載體時，可在30℃培養16小時后，將溫度提高到42℃的方法誘導表達外源蛋白質。

2.酸性磷酸酶基因的突變與篩選對核苷具有較高親和性的酸性磷酸酶。

酸性磷酸酶基因的突變的方法不受限制，只要能使酸性磷酸酶產生突變即可。比如可以用紫外光輻射或者用人工誘變劑處理含有該酶基因的微生物，也可以用定點突變的方法直接突變，或者DNA改組(DNA?shuffling)的方法定向突變。

篩選對核苷具有較高親和性的酸性磷酸酶的方法不做限制，只要能快速而高效的篩選到表達對核苷具有較高親和性的酸性磷酸酶的微生物即可。

3.以酸性磷酸酶催化核苷與磷酸基團供體合成5’-核苷酸。

使用的酸性磷酸酶的來源不做限制，只要能催化核苷與磷酸基團供體合成相應的5’-核苷酸即可。比如可以是經過初步抽提的粗酶，也可以是源自細菌的非增殖的完整細胞作為酶源。在特別推薦的方案中，本發明使用表達外源酸性磷酸酶的基因工程菌作為酶源。