技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說，是關于一種莽草酸生產菌株及其構建方法。

背景技術

莽草酸(Shikimic?acid)是合成生物體內新陳代謝化合物的中間體，也是合成許多生物堿、芳香氨基酸與吲哚衍生物、手性藥物(如抗病毒藥)的原料。莽草酸的分子結構中有三個羥基、一個羧基、一個雙鍵，具有手性異構體，它可以成酯，也可以成鹽。莽草酸化學名稱為3，4，5-三羥基-1-環己烯-1-羧酸，其結構式如下：

達菲(Tamiflu)目前認為是抗H5N1型高致病性禽流感病毒的最有效藥物，而莽草酸正是生產達菲的上游關鍵原料。

目前，莽草酸主要由中國廣西生長的中藥八角的種子萃取提純而來。八角含有多種化合物，有的對人體有害。多食八角非但不能醫治禽流感，反而會引起身體不適。從八角提取的莽草酸，再經過十幾步反應得到的Tamiflu(達菲)才是抗禽流感病毒藥。瑞士羅氏制藥公司擁有Tamiflu(達菲)生產的專利權，價格非常昂貴。

雖然羅氏公司和日本味之素已經發展出以生物工程手段生產莽草酸的方法，但從提純、生物活性及成本角度考慮，“達菲”的生產依然主要依賴中國廣西八角。目前，莽草酸和八角都已經短缺，價格上漲好幾倍，莽草酸每公斤在200～250美元之間，質量特別好的，價格高達每克50美元。

因此，利用葡萄糖甚至更廉價的可再生資源，通過微生物來發酵生產莽草酸，從而開辟新的原料制備途徑，是業內所追求的目標。微生物繁殖快、代謝能力強，通過利用其莽草酸代謝途徑進行改造，可獲得目標產物莽草酸的有效積累，解決達菲制備原料不足的瓶頸。國外一些公司已開展相關研究，但實現產業化還需進一步優化條件。

發明內容

本發明的目的就在于通過基因工程的方法對大腸桿菌的莽草酸合成途徑進行改造，從而提供一種莽草酸的生產菌株。

本發明的另一個目的在于提供所述莽草酸生產菌株的構建方法。

本發明的莽草酸生產菌株的構建方法包括以下步驟：

A、構建aroL和aroK雙基因敲除的菌株W3110(ΔaroL?ΔaroK)；

B、構建含有莽草酸代謝途徑中的關鍵基因aroF、aroE、aroB、ppsa以及tktA基因的重組表達質粒pSUFEBPT；

C、將重組表達質粒pSUFEBPT轉入雙敲除菌株W3110(ΔaroL?ΔaroK)獲得表達莽草酸的生產菌株。

本發明所構建的莽草酸生產菌株W3110(ΔaroL?ΔaroK)已于2006年9月4日提交位于武漢的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCC?M?206083。

利用本發明所獲得的基因工程菌株CCTCC?M?206083進行發酵，可以獲得目的產物莽草酸的有效積累，從而為莽草酸生產的產業化奠定了基礎。

附圖說明

圖1為單敲除菌株BW25113(ΔaroK)的PCR鑒定結果示意圖，顯示aroK基因已經被敲除；其中泳道1：野生型BW25113菌株PCR產物(1.3kb)；泳道2-5：ΔaroK-773/BW25113突變株PCR產物(2.1kb)；泳道6：DNA?marker。

圖2為單敲除菌株BW25113(ΔaroL)的PCR鑒定結果示意圖，顯示aroL基因已經被敲除；其中泳道1：DNA?marker；泳道2-4：ΔaroL-778/BW25113突變株；泳道5：野生型BW25113菌株。

圖3為雙敲除菌株BW25113(ΔaroLΔaroK)以引物aroL-up和aroL-down進行PCR鑒定的結果示意圖，顯示aroL基因已經被敲除；其中泳道1：野生型BW25113菌株；泳道2-3：ΔaroL-778/BW25113突變株；泳道4：DNA?marker。

圖4為雙敲除菌株BW25113(ΔaroLΔaroK)以引物aroK-up和aroK-down進行PCR鑒定的結果示意圖，顯示aroK基因已經被敲除；其中泳道1：DNA?marker；泳道2：野生型BW25113菌株；泳道3-6：ΔaroK-773/BW25113突變株。