本發明提供了編碼pfkA基因的核苷酸序列，和通過具有擴增的pfkA基因的棒狀細菌發酵生產L-氨基酸特別是L-賴氨酸的方法。

氨基酸特別是L-賴氨酸用于人用藥物和制藥工業，特別是動物營養。

已知氨基酸可通過棒狀細菌菌株，尤其谷氨酸棒桿菌的發酵而生產。由于其極其重要性，已持續進行改良生產方法的嘗試。生產方法的改良可涉及發酵措施，如攪拌和供氧，或營養培養基的組成如發酵期間的糖濃度，或產物形式的加工方法，例如通過離子交換層析，或微生物本身的固有生產性質。

為改良這些微生物的生產性質，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法，以此方法可獲得對抗代謝物如賴氨酸類似物S-(2-氨基乙基)半胱氨酸有抗性或重要的調節代謝物營養缺陷的并產生L-氨基酸如L-賴氨酸的菌株。

一段時間以來，重組DNA技術的方法也用于棒桿菌生產氨基酸的菌株的改良，其是通過擴增各個生物合成基因并研究對氨基酸生產的作用而進行。這一主題的綜述文章可在Kinoshita(“谷氨酸細菌”，工業微生物的生物學，Demain和Soloman編輯，BenjaminCummings，英國倫敦，1985，115-142)，Hilliger(BioTec?2，40-44(1991))，Eggeling(氨基酸6：261-272(1994))，Jetten和Sinskey(生物技術學關鍵綜述15，73-103(1995))和Sahm等(紐約科學學會年報782，25-39(1996))。

本發明人目的在于為改良氨基酸尤其是L-賴氨酸的發酵生產而提供新措施。

氨基酸、尤其是L-賴氨酸用于人用藥物及制藥工業，特別是動物營養，因此提供生產氨基酸特別是L-賴氨酸的新改良方法總是令人感興趣的。

當下文提到L-賴氨酸或賴氨酸時，不僅是指堿，也指鹽，如賴氨酸單鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽。

本發明提供了一種來自棒狀細菌的分離的多核苷酸，其含有選自如下一組的多核苷酸序列：

a)與編碼含有SEQ?ID?NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，

b)編碼含有與SEQ?ID?NO：2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，

c)與a)或b)的多核苷酸互補的多核苷酸，以及

d)含有a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15個連續堿基的多核苷酸。

本發明還提供了根據權利要求1的多核苷酸，其優選包括能復制的DNA，含有

(ⅰ)SEQ?ID?NO：1的核苷酸序列，或

(ⅱ)在遺傳密碼簡并范圍內相應于(ⅰ)序列的至少一個序列，或

(ⅲ)與互補于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列雜交的至少一個序列，和任選地，

(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有義突變。

本發明還提供了

權利要求4的多核苷酸，含有SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列，

權利要求6的多核苷酸，其編碼含有SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列的多肽，

含有權利要求1的多核苷酸序列的載體，特別是穿梭載體或質粒載體，

以及作為宿主細胞的含有載體的棒狀細菌。

本發明還提供了基本上由多核苷酸序列組成的多核苷酸，其可通過用含有相應于SEQ?ID?NO：1所述多核苷酸或其片段的序列的探針雜交合適的基因文庫，并分離所述的DNA序列來篩選獲得，所述的文庫包括具有相應于SEQ?ID?NO：1的所述多核苷酸序列的完整基因。

本發明的多核苷酸序列適用作RNA、cDNA和DNA的雜交探針，以分離編碼果糖磷酸激酶的全長cDNA，以及分離與果糖磷酸激酶基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。

本發明的多核苷酸序列還適用作通過聚合酶鏈反應(PCR)制備編碼磷酸果糖激酶的基因的DNA的引物。

作為探針或引物的這種寡核苷酸含有至少30個、優選至少20個、特別優選至少15個連續核苷酸。具有至少40或50個核苷酸的寡核苷酸也是合適的。

“分離的”是指從其天然環境中分離出來。

“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脫氧核糖核苷酸，其可以是非修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA。

“多肽”應理解為包括經肽鍵結合的兩個或多個氨基酸的肽或蛋白質。

本發明的多肽包括SEQ?ID?NO：2的多肽，特別是具有果糖磷酸激酶生物學活性的多肽，以及與SEQ?ID?NO：2的多肽至少70％相同的多肽，優選地與SEQ?ID?NO：2的多肽至少80％、特別是90-95％相同并具有所述活性的多肽。