本發明涉及生產人溶菌酶的DNA重組技術。更具體地說，本發明涉及人溶菌酶基因的表達、重組質粒、轉化細胞及其產物。

溶菌酶是一種較小的酶蛋白，分子量約為14，000。溶菌酶分布于活體組織中，人們認為它是作為防御物質起作用的，它通過溶解各種細菌而抵抗細菌感染。溶菌酶的功能可能是通過β-葡糖苷酶活性來溶解細菌細胞壁的多糖。雞蛋清中含有大量溶菌酶，因此從中能夠比較容易地分離到高純度的溶菌酶。這樣的溶菌酶可為了防腐目的加到干酪、香腸和海產品中，或用于將牛奶轉化成人的哺乳奶（Katsuya????Hayashi和Taiji????Imoto，《溶菌酶》，Nankodo，Japan，1974）。而且，溶菌酶作為醫用藥劑可用于止血、消炎、組織再生和抗腫瘤等（參見“Saikin-no-Sh-inyaku”（日本新藥）Vol.34：107，Yakuji????Nippo，Tokyo，Japan，1983），并且，它已經作為消炎酶藥劑上市了。

將來自蛋清的溶菌酶用于醫療目的時，通常導致過敏癥狀如疹子和發紅等。這些現象一般稱為對外源蛋白免疫應答的副作用。為了克服上述弊病，本發明者開始了研究以建立一種大量生產人溶菌酶的方法。

人溶菌酶的氨基酸序列是已知的，它由130個氨基酸組成（“Bio-chemical????Data????Book”，1：189，1979，日本生化學會主編）。以此氨基酸序列為基礎，化學合成了編碼人溶菌酶的DNA片段（Ik-ehara，M.等人，Chem.Pharm.Bull.，34：2202，1986）。

為了利用DNA重組技術生產人溶菌酶，Muraki等人試圖在大腸桿菌中進行表達，但用這種表達系統沒能得到活性人溶菌酶（Mura-ki，M.等人，Agric.Biol.Chem.，50：713，1986）。

已經發現，通過酵母的分泌作用得到了一種活性人溶菌酶（Jig-ami等人，《1986年日本農業化學學會概要》，P.343，1986）。但其產量非常低，只有600微克/升。根據Jigami等人的報導，在人溶菌酶的表達中，與編碼人溶菌酶的DNA片段相結合，使用了一種編碼信號肽的CDNA片段，此信號肽具有將所需蛋白分泌到細胞外的信息。作為編碼信號肽的CDNA片段，使用的是編碼蛋清溶菌酶信號肽的CDNA片段（天然型）（此信號肽序列與Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5759-5763，1980中公開的相同）。然而，進行了這樣的結合后，如上所述，從酵母細胞中分泌到胞外的溶菌酶數量仍然很少。

本發明者利用DNA重組技術對于活性人溶菌酶的大規模生產進行了詳盡的研究，研究結果是完成了本發明。

雖然，人溶菌酶基因目前還未被克隆，但已經確定了溶菌酶的氨基酸序列。因此，以此氨基酸序列為基礎，Ikehara等人已經化學合成了編碼人溶菌酶的DNA（Ikohara，M.等人，同上）。

因此，有可能利用此化學合成的DNA通過DNA重組技術大量生產人溶菌酶。

作為與編碼人溶菌酶的DNA片段一起使用的編碼信號肽的DNA片段，可以提及的有編碼上述蛋清溶菌酶信號肽的CDNA片段（天然型）。考慮到要在酵母中進行表達，因此，最好是利用酵母中高頻率使用的密碼制備編碼蛋清溶菌酶信號肽的DNA片段。使用這樣的DNA片段，發現能以增加的水平達到大量獲取人溶菌酶的預定目標。密碼子使用率已有過報道（J.Biol.Chem.，257：3026-3031，1982）。優選的酵母密碼子的實例在下面以RNA密碼子的形式給出。

氨基酸????密碼????氨基酸????密碼????氨基酸????密碼

Ala????GCU，GCC????His????CAC????Tyr????UAC

Ser????UCU，UCC????Glu????GAA????Cys????UGU

Thr????ACU，ACC????Gly????GGU????Asn????AAC

Val????GUU，GUC????Gln????CAA????Pro????CCA

Ile????AUU，AUC????Lys????AAG????Met????AUG

Asp????GAC????Leu????UUG????Trp????UGG

Phe????UUC????Arg????AGA

圖1給出了通過寡聚核苷酸的集中和連接合成人溶菌酶基因的方法的示意圖;

圖2表明人溶菌酶基因中TaqI-XhoI片段的DNA序列;

圖3表明本發明以蛋清溶菌酶信號肽為基礎制備的DNA序列;