本發明屬酶制劑的提純方法。

隨著酶制劑發酵工業的迅速發展，發酵產品的分離純化技術日顯迫切需要，將發酵所得酶制劑應用于食品加工業之前，必須先將粗酶制品中所含的不符合衛生要求、有使人不愉快氣味和色澤的種種雜質除去，方可應用。1977年前后，西德學者M.-R.Kula等人將水兩相系統應用于酶制劑工業生產過程。他們采用葡聚糖、聚乙二醇、水所構成的兩相系統，分離純化了克雷伯氏肺炎菌（Klebsie-lla????pneumoniae）產生的異淀粉酶（普魯蘭酶）和1，4葡聚糖磷酸化酶，以及由大腸桿菌產生的三種氨基酰tRNA合成酶，并獲得專利權〔西德專利DE2616584（1977）〕，采用葡聚糖、聚乙二醇、水兩相系統，雖可對細胞、細胞器、病毒、蛋白質、核酸等生物大分子或顆粒進行分離純化，但由于葡聚糖的價格十分昂貴，不利于大規模工業生產上使用。

本發明的任務是給酶制劑大規模生產過程提供一種成本低廉、操作簡單、效率高而且安全的分離純化技術，使經過純化的產品可供食品加工業及其它方面應用。

本發明采用了價格低廉的、對人畜安全的高聚物、鹽、水構成的兩相系統，對酶制劑進行分離提純。具體做法是：用聚乙二醇（簡稱PEG）、鹽、水構成的兩相系統，通過液、液萃取操作方法（見具體操作方法），純化發酵生產的枯草桿菌α-淀粉酶，以及其它酶制劑（包括蛋白酶、脂肪酶等發酵生產的酶制劑），使之能適用于食品加工工業。

枯草桿菌α-淀粉酶是工業發酵液噴干粉，它內部含有大量雜質（包括培養基附隨物、細菌菌體、色素等），并帶有不愉快的氣味。利用α-淀粉酶、雜質在水兩相系統中有不同的分配行為，可以將它們分離。首先令粗酶混懸液于〔10～30%（最好是20.5%）PEG/10～20%（最好是13.7%）（NH₄）₂SO₄〕兩相系統中進行分相，分相后，90%以上的α-淀粉酶存在于上層相（PEG相）中;不溶性物質（如菌體、培養基附隨物）聚集于兩相界面;親水性色素則分布于下層相（硫酸銨相）。去除下層相后，加入適量磷酸鹽（Na₂HPO₄-NaH₂PO₄）緩沖液，構成10～30%（最好是13.7%）PEG/10～30%（最好是10%）磷酸鹽兩相系統，此時α-淀粉酶轉入新的下層相里（即磷酸鹽相），而其它雜質、色素則存留于上層PEG相中。去除上層相后，就可以獲α-淀粉酶溶于磷酸緩沖液中的液態制劑。這種液態α-淀粉酶制劑無色、無味。經透析除鹽、凍干，便可制成粉狀制劑，可用于食品加工業，或供進一步精制的中間原料。

提純α-淀粉酶所用試劑有下列幾種：

1.50%（每一百克溶液含PEG50克。以下均同）聚乙二醇（PEG6000）膠態溶液。

2.50%（每一百毫升溶液含硫酸銨50克。以下均同）硫酸銨（NH₄）₂SO₄溶液。

3.25%（每一百毫升溶液含磷酸鹽25克，以下同）磷酸鹽〔Na₂HPO₄-NaH₂PO₄〕緩沖液，PH值為6.0。

4.12.5%（每一百毫升溶液中含酶制品12.5克）枯草桿菌α-淀粉酶粗酶混懸液。

具體操作方法如下：

1.取容積為125毫升帶刻度的液漏斗，稱重加入50%PEG溶液10～30克（最好是20.5克），終濃度為10～30%（最佳為20.5%），用移液管加入50%（NH₄）₂SO₄溶液10～20毫升（最好是13.7毫升），終濃度為10～20%，（最好為13.7%），12.5%粗酶液16.0毫升。系統總體積為50毫升（以上重量、體積均可按比例放大或縮小）。充分搖蕩均勻，靜置待分層清晰后，記錄上下相體積，各取出1毫升，進行酶活力及蛋白質濃度測定。

2.從分液漏斗放出下層相。上層相仍留在分液漏斗中，再加入25%磷酸鹽緩沖液35毫升，蒸餾水25毫升（以上重量、體積均可按比例放大，縮小）。充分搖勻，靜置分層記錄兩相體積。各取出1毫升，按Bernfeld法測α-淀粉酶活力及蛋白質濃度。在581-G型比色計中使用綠色濾光片追蹤黃色色素的分布動向。

3.分出下層相得α-淀粉酶精制品濃液中透析除鹽，凍干即得成品。

在本項發明“高聚物、鹽、水”兩相系統中，所用高聚物聚乙二醇完全無毒，對人畜安全，是合格的食品填充劑。由于構成兩相系統的主要成份是水，因而有利于酶蛋白的穩定性;使用本系統所需設備簡單，操作方便，分離迅速，效率高，操作規模可以根據生產情況準確放大和縮小。且原材料成本低廉，適宜于大規模工業生產過程的使用。