本發明屬生物工程技術領域，特別是涉及一種利用微生物發酵技術制備膽固醇酯酶的工藝。膽固醇酯酶能夠水解膽固醇酯為游離酯肪酸和膽固醇，分解得到的膽固醇進一步經膽固醇氧化酶、過氧化物酶催化的反應，可測定血清中總膽固醇的含量，反應過程如下：

以上反應原理已普遍應用于臨床診斷，是測定人血清中總膽固醇含量的準確、快速、靈敏的方法。在上述反應中，于37℃每分鐘將1微克分子膽固醇酯分解成膽固醇和脂肪酸的酶量定為膽固醇酯酶的1個活力單位。1974年，Allain和Richmonds等人首先應用牛胰膽固醇酯酶，微生物來源的膽固醇氧化酶，辣根過氧化物酶等三酶偶聯測定血清總膽固醇及游離膽固醇的含量，從而確立了酶法測定膽固醇含量的基礎。但是，用牛胰生產膽固醇酯酶有許多缺點：（1）原料來源受限制，（2）牛胰破碎后成份復雜，且含有胰旦白酶等蛋白水解酶類，給分離、提取膽固醇酯酶帶來許多困難，（3）牛胰膽固醇酯酶的熱穩定性差。能克服這些缺點而更適合于工業生產的是從微生物中獲得膽固醇酯酶。日本、西德、美國已先后從細菌、諾卡氏菌、鏈霉菌、霉菌中發酵得到此酶。日本學者曾經從Pseudomonas菌屬中發酵得到膽固醇酯酶（日本公開特許公報，昭54-113493），其在培養基中加入油酸、亞油酸及其膽固醇酯時，該菌株能同時發酵生產膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，在一般的碳源中，只能生產膽固醇氧化酶，同時發明了分離膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶的方法（日本公開特許公報，昭54-138188），但未見將二酶配制成酶聯制劑的報道。

本發明的目的是采用簡便的制備工藝從微生物中獲得符合臨床分析要求的膽固醇酯酶。

本發明的任務是以如下方式完成的：將經過生理生化特征和形態培養特征鑒別為假單胞菌（Pseudomohas）的菌種（該菌種不管改用何種碳源或氮源只產生膽固醇酯酶，不產生膽固醇氧化酶）接種于以酵母膏，尿素為氮源;甘油為碳源;油酸、亞油酸及其膽固醇酯，或豆油、豆磷酯、卵磷酯、α-甘油磷酸等為誘導劑;以及各種無機鹽的培養基中，在通氣，攪拌的條件下，提高發酵產酶單位，發酵液經過分離、提取、鹽析、柱層等步驟，制得膽固醇酯酶。用此酶配制而成的酶聯試劑的穩定性，澄明度均明顯優于用胰臟膽固醇酯酶配得酶聯試劑。以此酶聯試劑測定血清中總膽固醇含量數據與用胰臟酯酶配得的酶聯試劑測定完全一致，且工藝簡單，成本低。

實例一

將冷凍管保存的Pseudomonas菌種接種在肉湯斜面培養基中，37℃培養，待菌體長好后，接種于含有0.2～0.5%酵母膏，0.5～1.0%甘油，0.05～0.15%K₂HPO₄，0.1～0.3%尿素0.05%KCl，0.05～0.15%MgSO₄，0.2～0.5%豆油，PH6.7～7.2，50ml發酵培養基中，搖床230轉/min，30℃培養36～40小時，培養結束，用3500轉/min離心除去上清液，并用蒸餾水洗滌菌體，離心棄上清液，加入含表活性劑tritonX-100的tr;s-HCl緩沖液提取膽固醇酯酶，測得膽固醇酯酶發酵單位為0.2～0.4U/ml。

實例二

用50L缶，將例一中的搖瓶種子接入裝有含0.5～1.5%酵母膏，0.5～1.5%甘油，0.2～0.3%尿素，0.05～0.15%K₂HPO₄，0.02～0.05%KCl，0.02～0.05%MgSO₄，0.1～0.2%油酸，0.1～0.2%卵磷酯，PH值為6.7～7.2，并經120℃，1.1Kg/cm²滅菌的30L培養基中，用1∶1V/V/min，30～33℃，培養30～40小時。

同實例一處理菌體得膽固醇酯酶提取液，測得膽固醇酯酶發酵單位200～400U/l。