本發明涉及基因工程技術領域，公開了一種大腸桿菌腸毒素多表位融合蛋白及其制備方法和應用，本發明以產腸毒素大腸桿菌不耐熱腸毒素A(LTa)作為骨架蛋白，將產腸毒素大腸桿菌耐熱腸毒素A(STa)和B(STb)的中和表位替換LTa免疫原性較弱的表位，通過融合表達制備重組蛋白；所得重組蛋白能夠高效表達，且可以將STa和STb的表位展示出來，有效解決了因STa和STb分子量較小導致的免疫原性較弱、表達量差等問題。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及了一種大腸桿菌腸毒素多表位融合蛋白及其制備方法和應用。

背景技術

產腸毒素大腸桿菌(ETEC)是引起仔豬腹瀉的主要病原菌。據報道，全世界每年因ETEC造成仔豬死亡約占一半以上，給生豬養殖業造成巨大的損失。ETEC主要的致病因素是其產生的腸毒素，包括耐熱型腸毒素A(STa)、耐熱型腸毒素B(STb)、不耐熱型腸毒素A(LTa)和不耐熱型腸毒素B(LTb)。其中，耐熱型腸毒素具有較強的致病性，可使仔豬腸道黏膜萎縮，脫落，誘發炎癥，導致仔豬腹瀉，進而死亡。除此之外，STa和STb還能夠污染水源、食物等，有研究表明ETEC是發展中國家幼兒死亡的重要原因之一，也是人類公共衛生的一個重要危險。然而，由于STa和STb分子量較小，免疫原性較弱，表達量差，毒性強等問題，目前市場上，還未開發出針對STa和STb的有效的疫苗或中和活性的抗體。研究如何能夠展示STa和STb抗原表位，已經成為一個研究熱點。

多表位融合抗原是一種基于抗原結構和表位的疫苗技術，為多價疫苗的開發提供了新的平臺。通過模擬抗原的天然表位并呈遞多個異源中和表位，多表位融合抗原允許單個免疫原(蛋白質)攜帶來自多種毒力決定簇的多種抗原性元素(表位或肽)，從而具有廣泛的免疫原性，可以廣泛開發免疫原性多價疫苗。

發明內容

有鑒于此，本發明利用LTa作為骨架蛋白，將STa和STb中和表位展示在LTa上得到重組蛋白，能有效解決STa和STb分子量較小，免疫原性較弱，表達量差，毒性強等問題，并有望改善仔豬腹瀉頻發、死亡率高、疫苗保護效率差等現狀。

本發明的技術方案具體如下：

本發明第一方面提供了一種大腸桿菌腸毒素多表位融合蛋白，具體為如下任一：

(i).氨基酸序列為SEQ ID NO:1的蛋白質；

(ii).將SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質；

(iii).在(i)或(ii)所述蛋白質的N端和/或C端連接標簽后得到的蛋白質。

本發明第二方面提供了制備上述大腸桿菌腸毒素多表位融合蛋白的方法，包括以下步驟：

S1.克隆LTa基因，篩選LTa免疫原性較弱的表位，克隆STa的中和表位和STb的中和表位，將所述STa和STb的中和表位替換LTa免疫原性較弱的表位；

S2.將替換后的基因克隆在載體上，構建重組載體，轉入宿主菌株中進行誘導表達；

S3.提取純化目的蛋白。

優選地，所述LTa免疫原性較弱的表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；所述STa中和表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，克隆所述STa中和表位所用的引物序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示；所述STb中和表位的氨基酸序列SEQ ID NO:7所示，克隆所述STb中和表位所用的引物序列如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示。

優選地，所述載體為PET質粒，包括但不限于：PET28a、PET30a、PET32a。