本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于傳代干細(xì)胞的無(wú)動(dòng)物源傳代方法，具體涉及一種臨床級(jí)干細(xì)胞無(wú)動(dòng)物源成分消化液、消化終止液的制備及干細(xì)胞無(wú)動(dòng)物源傳代方法。一種用于傳代臨床級(jí)干細(xì)胞的無(wú)動(dòng)物源傳代方法包括以下步驟：提取人羊膜、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)至第三代，進(jìn)行細(xì)胞鑒定；將第三代人羊膜、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種于75cm²培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待匯合度達(dá)到80?90%；應(yīng)用無(wú)動(dòng)物源成分消化液、消化終止液將人羊膜、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代。本發(fā)明提供的用于傳代干細(xì)胞的無(wú)動(dòng)物源傳代方法，既符合無(wú)動(dòng)物源成分標(biāo)準(zhǔn)，又能有效消化干細(xì)胞至單細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)而均勻接種干細(xì)胞，達(dá)到最佳培養(yǎng)狀態(tài)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于傳代干細(xì)胞的無(wú)動(dòng)物源傳代方法，具體涉及一種臨床級(jí)干細(xì)胞無(wú)動(dòng)物源成分消化液、消化終止液的制備及干細(xì)胞無(wú)動(dòng)物源傳代方法。

背景技術(shù)

干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞。研究表明，干細(xì)胞在一定條件下能誘導(dǎo)分化成多種構(gòu)成人體的功能細(xì)胞，是形成人體各種組織、器官的種源細(xì)胞，是人體器官再生和修復(fù)的秘密所在。

無(wú)動(dòng)物源成分培養(yǎng)基是臨床級(jí)干細(xì)胞生產(chǎn)過(guò)程中提取培養(yǎng)常用的一類培養(yǎng)基，因其生產(chǎn)過(guò)程中不接觸任何含有提取自動(dòng)物來(lái)源的組分，故能夠有效的避免異種蛋白過(guò)敏及異種病原體感染。目前，已有幾個(gè)國(guó)內(nèi)外品牌的無(wú)動(dòng)物源成分培養(yǎng)基獲得了美國(guó)FDA認(rèn)證，為干細(xì)胞培養(yǎng)及臨床應(yīng)用提供了新途徑。

目前發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)干細(xì)胞均為貼壁細(xì)胞，其生長(zhǎng)有賴于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，在細(xì)胞增殖的過(guò)程中需要將貼壁細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)瓶上消化下來(lái)以進(jìn)行進(jìn)一步操作。傳統(tǒng)的胰蛋白酶提取自豬的胰腺，在應(yīng)用過(guò)程中難以避免異種蛋白過(guò)敏及豬來(lái)源病原體感染。近期發(fā)明的溫和消化酶及溫和細(xì)胞解離試劑等消化液能夠代替胰蛋白酶進(jìn)行傳代消化，但由于缺乏胰蛋白酶相關(guān)組分，導(dǎo)致消化過(guò)程延長(zhǎng)以及消化不均勻等缺陷，容易形成細(xì)胞團(tuán)塊，嚴(yán)重影響干細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種臨床級(jí)干細(xì)胞無(wú)動(dòng)物源成分消化液、消化終止液的制備及干細(xì)胞無(wú)動(dòng)物源傳代方法，本發(fā)明提供的用于傳代干細(xì)胞的無(wú)動(dòng)物源傳代方法，既符合無(wú)動(dòng)物源成分標(biāo)準(zhǔn)，又能有效消化干細(xì)胞至單細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)而均勻接種干細(xì)胞，達(dá)到最佳培養(yǎng)狀態(tài)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。

一種用于消化干細(xì)胞的無(wú)動(dòng)物源成分的消化液，以濃度單位mg/L計(jì)，是由以下濃度的組分組成：EDTA-2Na 100～150、重組人胰蛋白酶50～100、磷酸氫二鉀50～70、氯化鉀350～450、碳酸氫鈉300～400、氯化鈉7000～9000。

一種用于終止干細(xì)胞消化的消化終止液，以濃度單位mg/L計(jì)，是由以下濃度的組分組成：氯化鈉7000～9000、十二水合磷酸氫二鈉100～150、氯化鉀350～450、磷酸二氫鉀50～70、硫酸鎂80～100、氯化鈣100～150、D-葡萄糖900～1100、碳酸氫鈉300～400、人血白蛋白350～450。

一種用于傳代干細(xì)胞的無(wú)動(dòng)物源傳代方法，具體包括以下步驟。

步驟1、取出應(yīng)用無(wú)動(dòng)物源成分培養(yǎng)基培養(yǎng)中的干細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，應(yīng)用PBS清洗細(xì)胞2次，吸出培養(yǎng)瓶中的液體。

步驟2、按25cm²/mL將上述無(wú)動(dòng)物源成分消化液加入培養(yǎng)瓶中，使細(xì)胞完全浸入消化液中，棄去多余消化液。

步驟3、置于37℃，飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO₂培養(yǎng)箱中1～2分鐘。

步驟4、取出培養(yǎng)瓶，按V_{消化終止液}:V_{無(wú)動(dòng)物源成分消化液}＝1：1體積加入上述消化終止液并混勻，用吸管輕柔收集細(xì)胞懸液。

步驟5、1000rpm離心5分鐘，棄上清。