本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了BNAM79EPSPS抗草甘膦基因及其應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)AM79EPSPS不同區(qū)域的活性分析及雙子葉植物(油菜)基因組特點(diǎn)，對AM79EPSPS的密碼子進(jìn)行了改造，改造，經(jīng)過密碼子優(yōu)化的AM79EPSPS基因命名為BNAM79EPSPS。通過對轉(zhuǎn)AM79EPSPS基因及BNAM79EPSPS基因的作物不同轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的分析，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)BNAM79EPSPS基因更容易獲得高表達(dá)量的轉(zhuǎn)基因作物以及顯著提高獲得耐受高倍(4倍以上)草甘膦的轉(zhuǎn)基因作物的幾率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說是涉及BNAM79 EPSPS抗草甘膦基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

大豆是世界上重要的油料作物和高蛋白糧食作物之一，也是人類植物性蛋白和油脂的重要來源。近年，在大豆產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，供需矛盾日益嚴(yán)重的形勢下，轉(zhuǎn)基因技術(shù)己成為大豆新品種培育的重要手段。根據(jù)2016年國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(ISAAA)發(fā)布的報告(James,2016)，自1996年美國孟山都公司研制的抗草甘膦(glyphosate_resistant，GR)轉(zhuǎn)基因大豆被批準(zhǔn)商業(yè)化以來，全球轉(zhuǎn)基因大豆種植面積逐年上升，至2016年達(dá)到9140萬hm²，占全球大豆總面積的78％，占全球轉(zhuǎn)基因作物總種植面積的一半。抗除草劑作物的創(chuàng)制是近代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中最活躍、最具成效的領(lǐng)域，抗草甘膦作物則是抗除草劑作物中的核心，其中抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆居于首位(沈彬等，2018)。

草甘膦作為一種芳香族氨基酸合成過程中的抑制劑，其主要作用靶標(biāo)是EPSPS，植物中的內(nèi)源EPSPS基因編碼的5-烯醇丙酮酰-3-磷酸轉(zhuǎn)移酶(EPSPS)是植物體內(nèi)芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)生物合成途徑中的一個關(guān)鍵酶，而這些芳香族氨基酸都是構(gòu)建細(xì)胞蛋白最基本的氨基酸。在這一生物合成途徑中，EPSPS酶催化莽草酸-3-磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-烯醇式丙酮酸莽草酸-5-磷酸。除草劑草甘膦可以抑制植物內(nèi)源EPSPS的活性，從而阻斷芳香族氨基酸的合成，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡(Zabalza et al.,2016)。EPSPS基因廣泛存在于細(xì)菌、真菌和高等植物中，而在哺乳動物中不存在(崔云云等，2016)。通常來自細(xì)菌和高等植物EPSPS基因?qū)Σ莞熟⒚舾校壳耙褟募賳伟鶳G2982、根癌農(nóng)桿菌CP4、無色桿菌LBAA和金黃色葡萄球菌(Staphycoccus aureus)等中克隆到具有天然的草甘膦抗性EPSPS基因(Heet al.,2001)。由于CP4-EPSPS基因有高抗草甘膦的特性，目前是使用最廣泛的抗性基因。AM79-EPSPS蛋白與應(yīng)用廣泛的CP4 EPSPS蛋白同屬于EPSPS家族類蛋白(林敏等，2007)。來自土壤微生物的AM79-EPSPS基因編碼的蛋白屬于5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)，氨基酸序列與報道的Agrobacterium sp EPSPS酶的氨基酸序列同源性僅為22％，兩者差異性顯著。該基因專利“高耐受草甘膦的EPSPS合酶及其編碼序列”(專利號：CN200710177090.1)。AM79-EPSPS基因編碼產(chǎn)生的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(AM79-EPSPS)蛋白與植物內(nèi)源性EPSPS蛋白相比，對草甘膦的親合力大大降低，在草甘膦存在的條件下保證了植物對芳香氨基酸的合成。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以打破生物之間的不親和性，把外源具有優(yōu)良性狀的基因整合到大豆基因組，培育出抗除草劑、優(yōu)質(zhì)等大豆品種，最終達(dá)到增加大豆產(chǎn)量的目的。然而現(xiàn)有的AM79 EPSPS基因直接導(dǎo)入大豆，能夠篩選出其在大豆中表達(dá)量高轉(zhuǎn)化體的概率低，轉(zhuǎn)化體能耐受高倍(4倍以上)草甘膦的概率低，如何提高外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的穩(wěn)定性、高效性是轉(zhuǎn)基因研究中的一個亟待解決的重要問題。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供BNAM79 EPSPS抗草甘膦基因，使其能夠獲得耐受高倍(4倍以上)草甘膦的轉(zhuǎn)基因作物的幾率顯著提高并降低草甘膦藥害；

本發(fā)明的另外一個目的在于提供BNAM79 EPSPS抗草甘膦基因，使其能夠顯著提高在轉(zhuǎn)基因作物中的蛋白表達(dá)量；