本發明公開了一種鑒定莖用芥菜oxa細胞質雄性不育恢復基因的分子標記，屬于蔬菜分子育種技術領域。本發明通過對控制莖用芥菜oxa CMS恢復系中的基因片段進行PCR擴增，并與莖用芥菜細胞質雄性不育系中的基因序列進行比對，分別在基因序列保守和在恢復系中特異插入的一段核苷酸序列設計引物，設計開發了一對區分oxa CMS恢復基因有無的分子標記，在芥菜雜交育種中可以高效選育優良、穩定的oxa CMS恢復系。同時開發了另外一對鑒定oxa CMS恢復基因的基因型的分子標記，可以用于芥菜制種系統中雜交種的純度鑒定，縮短育種年限，提高育種效率。

技術領域

本發明屬于分子育種技術領域，具體涉及到一種鑒定莖用芥菜oxa細胞質雄性不育恢復基因相關的分子標記。

背景技術

細胞質雄性不育(CMS)是由于線粒體基因組的突變、重排或者重組產生異常開放閱讀框(ORFs),導致的雄蕊發育異常，而雌蕊卻正常發育的一種生物學現象。它主要表現為母性遺傳，能被顯性核恢復基因恢復育性。細胞質雄性不育是植物雜種優勢利用的主要途徑之一，同時也是研究細胞質遺傳以及線粒體和細胞核互作的良好媒介。

細胞質雄性不育植株是由于不能產生正常的功能性花粉而表現為雄蕊敗育，然而恢復系的顯性核恢復基因Rf卻能夠消除不育系中不育基因的作用，從而達到恢復育性的目的。Rf基因作為恢復植物育性和與CMS相關基因相互作用的重要遺傳手段，在不同植物間被廣泛報道。近年來，基于圖位克隆的方法，已在許多植物中成功地鑒定出細胞核中的線粒體特異性Rf基因，主要包括水稻WA-CMS的恢復基因Rf4(Tang et al.2014)；高粱A1-WA的恢復基因Rf1和Rf2(Jordan et al.2010)；油菜Polima CMS的恢復基因Rfp(Liu et al.2016)。還有植物中第一個分離到的恢復基因——玉米中的Rf2，編碼一個乙醛脫氫酶，恢復玉米T型不育胞質的育性(Cui et al.1996)。新Rf基因的克隆和鑒定將為CMS植株育性恢復的分子機制提供新的認識。

本課題組研究人員從2010年開始研究芥菜細胞質雄性不育源“oxa”的不育性特點及雜種優勢的利用。通過連續多年的雜交、回交和測交，創制了莖用芥菜oxa胞質不育系、保持系和恢復系。通過多年多點研究發現：該不育系的柱頭明顯外露，蜜腺發達，不育度和不育株率均為100％，且該不育系雜種優勢強，配合力高。同時細胞學觀察和線粒體不育基因的分子標記鑒定發現：oxa CMS與已報道的十字花科不育類型均不相同，是一種新的細胞質雄性不育類型。因此進一步挖掘和克隆oxa CMS相關的不育基因和恢復基因，揭示CMS/Rf的生物學功能和作用機理，就顯得尤為重要。本發明致力于開發一種精確區分oxa CMS恢復基因有無的分子標記，將其應用于快速準確鑒定利用oxa系統進行制種的雜交種純度。

發明內容

本發明的目的是提供一種莖用芥菜oxa細胞質雄性不育恢復基因的分子標記，該分子標記特異性強，重復性好，可以高效鑒定芥菜株系中是否有恢復基因的存在，從而在苗期鑒定植株是否具有對oxa CMS的恢復功能，以加快莖用芥菜雜交種純度鑒定和新品種的選育，為中國特色蔬菜-莖用芥菜的產量性狀育種提供理論依據和材料來源。

本發明通過以下技術方案得以實現：

一種區分莖用芥菜oxa CMS恢復基因有無的分子標記，包含一對SCAR標記，即BjGDI-F/R的引物組合，還有一種快速鑒定區分純合雜合莖用芥菜的分子標記，也包含一對SCAR標記：即CRY3-F/R的引物組合。其中BjGDI-F的引物序列為：GACAAGGCTCCTGCTCATTTAGG；BjGDI-R的引物序列為：CAATTACTTGGTCACATCGGTATGG；CRY3-F的引物序列為：GGTTCTAGCAGAGACTACAATGTTG；CRY3-R的引物序列為：GTCACATCGGTATGGATAAGGAC。

利用上述的分子標記區分莖用芥菜oxa CMS恢復基因的方法，包括以下步驟：

(1)提取莖用芥菜的葉片DNA；