本發明公開了一種機器學習基因挖掘方法及氨基轉位用草銨膦脫氫酶突變體。所述氨基轉位用草銨膦脫氫酶突變體由氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的野生型草銨膦脫氫酶突變所得，所述氨基轉位用草銨膦脫氫酶突變體的突變位點選自以下一種：(1)E263D?K134R?H96A?R290V；(2)E263D?K134R?H96A；(3)E263D?K134R；(4)E263D；(5)E263N；(6)E263C；(7)E263G。本發明利用定點飽和突變技術對SEQ ID No.1所示的草銨膦脫氫酶基因進行突變，發現第263位、第134位、第290位、第290位是影響酶活和立體選擇性的關鍵位點，獲得酶活和ee值遠高于母本草銨膦脫氫酶的突變體。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種機器學習基因挖掘方法及氨基轉位用草銨膦脫氫酶突變體。

背景技術

草銨膦(phosphinothricin，也叫glufosinate，簡稱PPT)的化學名稱為2-氨基-4-[羥基(甲基)膦酰基]-丁酸，是世界第二大轉基因作物耐受除草劑，由赫斯特公司(幾經合并后現歸屬拜耳公司)開發生產，又稱草銨膦銨鹽、Basta、Buster等，屬膦酸類除草劑，非選擇性(滅生性)觸殺型除草劑是谷氨酰胺合成酶抑制劑。

草銨膦有兩種光學異構體，分別為L-草銨膦和D-草銨膦。但只有L-型具有生理活性，且在土壤中易分解，對人類和動物的毒性較小，除草譜廣，對環境的破壞力小。

目前，市場上銷售的草銨膦一般都是外消旋混合物。若草銨膦產品能以L-構型的純光學異構體形式使用，可顯著降低草銨膦的使用量，這對于提高原子經濟性、降低使用成本、減輕環境壓力具有重要意義。

手性純L-草銨膦(L-PPT)的制備方法主要有三種：手性拆分法，化學合成法和生物催化法。生物催化法生產草銨膦則具有立體選擇性嚴格、反應條件溫和、收率高等優點，是生產L-草銨膦的優勢方法。主要包括以下三類：

1)以L-草銨膦的衍生物為底物，通過酶法直接水解獲得，主要的優點轉化率高，產物e.e.值較高，但需要昂貴且不易獲得的手性原料作為前體，成本加高，不利于工業化生產。例如生物法制備L-草銨膦最簡單的方法就是利用蛋白酶直接水解雙丙氨膦。雙丙氨膦是一種天然的三肽化合物，在蛋白酶的催化下，雙丙氨膦脫去2分子L-丙氨酸，生成L-草銨膦。

2)以外消旋草銨膦的前體為底物，通過酶的選擇性拆分獲得。主要優點為原料相對易得，催化劑活力高，但其理論收率只能達到50％，會造成原料的浪費。例如Cao等人(CaoC-H，Cheng F，Xue Y-P，Zheng Y-G(2020)Efficient synthesis of L-phosphinothricinusing a novel aminoacylase mined from Stenotrophomonas maltophilia.Enzyme andMicrobial Technology 135 doi：10.1016/j.enzmictec.2019.109493)采用一種來源于Stenotrophomonas maltophilia的新型的氨基?；甘中圆鸱諲-乙酰-PPT，得到L-草銨膦。用全細胞進行催化，在4小時內轉化率＞49％，獲得了光學純的L-PPT(＞99.9％e.e.)。