本發明公開了一種腈水解活性專一性提高的腈水解酶突變體及其應用，所述突變體是將SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第200位、第224位、第229位、第246位進行單突變或多突變獲得的。本發明構建的突變體C145N、K200R/R224W/A229P、K200R/R224W/N246V催化苯乙腈產生的主產物為苯乙酸，分別占產物含量的96.5％、96.3％和98.8％，腈水合活性比K200R/R224W分別下降88.3％、82.2％和94.3％，有利于定向生成目的產物苯乙酸。對腈水解酶的反應專一性調控使其能夠應用于酰胺和羧酸的綠色工業催化合成，具有重要意義。

(一)技術領域

本發明涉及一種腈水解活性專一性提高的腈水解酶突變體及在合成苯乙酸中的應用。

(二)背景技術

腈化合物是一類含氰基的有機化工原料，廣泛用于化工、醫藥、農藥和材料工業。腈水解酶能夠催化腈化合物水解生成羧酸，具有獨特的化學選擇性、立體選擇性和區域選擇性等優勢，在腈化合物轉化中發揮重要作用。一些腈水解酶除催化腈化合物水解生成羧酸外，同時具有腈水合活性。如Piotrowski等發現擬南芥腈水解酶同時具有腈水解和腈水合活性，能夠催化β-氰基-L-丙氨酸轉化為天冬酰胺和天冬氨酸，天冬酰胺的含量高達60％以上(J.Biol.Chem.,2001,276,2616-2621)。此外，Bradyrhizobium japonicum腈水解酶催化β-氨基丙腈水解，β-氨基丙酰胺的比例高達33％(J.Mol.Catal.B:Enzym.,2015,115,113-118)。

腈水解酶同時具有腈水解和水合活力的特性使其在生物有機合成中具有巨大潛力。提高腈水解酶的水解活性，專一性生成羧酸有利于產率的提高以及后期產物的分離純化，為腈水解酶工業化生產提供便利。因此，腈水解酶反應專一性的調控對腈水解酶的工業化應用有著重要的意義。

隨著基因工程技術的迅猛發展，通過分子改造可顯著提高腈水解酶的活性、穩定性及底物特異性等催化性能。近年來，腈水解酶反應專一性的調控也成為研究熱點。Gong等通過定點突變構建了雙突變體I128L-N161Q，催化3-氰基吡啶時，產物中羧酸含量提高至99.1％，催化活力提高了1.98倍(Catalysis ScienceTechnology,2016,6(12):4134-4141)。DeSantis等對腈水解酶全基因序列進行飽和突變改造，獲得了能夠在3M底物濃度下高效催化3-羥基戊二腈的突變體，其產物(R)-4-氰基-3-羥基丁酸是阿托伐他汀的關鍵手性中間體(Journal of the American Chemical Society,2003,125(38):11476-11477.)。張焱等改造水稻(Oryza sativa)腈水解酶OsNIT，突變體K200R/R224W以苯乙腈為底物時，羧酸含量達到95.1％(CN111321132A)，但是突變體K200R/R224W腈水合活性依舊為野生型的22.74％。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種高產羧酸的腈水解酶突變體、編輯基因、工程菌及應用，對OsNIT進行反應專一性調控，在保持水解活力的同時，提高羧酸含量，同時降低其水合活力從而降低酰胺含量。

本發明采用的技術方案是：

本發明提供一種腈水解活性專一性提高的腈水解酶突變體，所述突變體是將SEQID NO.1所示氨基酸序列第200位、第224位、第229位、第246位進行單突變或多突變獲得的。所述突變體可采用易錯PCR、定點飽和突變及組合突變構建獲得。所述SEQ ID NO.1所示氨基酸序列編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.2所示。