本發(fā)明提供了D117L、F317L和EP364R共表達重組腺病毒載體、重組腺病毒及構(gòu)建和應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，所述基因插入到pShuttle?CMV真核表達載體上，能夠用于構(gòu)建表達非洲豬瘟病毒D117L、F317L和EP364R蛋白的重組腺病毒，該重組腺病毒能夠直接感染真核細胞，從而實現(xiàn)D117L、F317L與EP364R基因在真核細胞中共表達的目的，為進一步研究基于共表達D117L、F317L與EP364R基因重組腺病毒載體疫苗打好基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及D117L、F317L和EP364R共表達重組腺病毒載體、重組腺病毒及構(gòu)建和應(yīng)用。

背景技術(shù)

非洲豬瘟(african swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African Swinefevervirus，ASFV)引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸傳染性疾病，其特征為病程短、病死率高，臨床癥狀和病理變化均類似于急性豬瘟，表現(xiàn)高熱、皮膚充血、流產(chǎn)、水腫及臟器出血。p17是ASFV表達的晚期膜蛋白，由ORF D117L基因編碼，是位于病毒內(nèi)膜的跨膜蛋白。p17是病毒前體膜形成二十面體過程中所必需的中間體，而且對于病毒活力至關(guān)重要。F317L及EP364R兩個基因編碼的蛋白在ASFV中含量較高，屬于中等偏上。但是目前還沒有針對這D117L、F317L和EP364R的重組腺病毒疫苗以及制備該重組腺病毒疫苗的重組腺病毒載體。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供D117L、F317L和EP364R共表達重組腺病毒載體、重組腺病毒及構(gòu)建和應(yīng)用。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種D117L、F317L和EP364R共表達的基因，所述基因是將EGFP基因、第一連接基因、D117L基因、第二連接基因、F317L基因、第二連接基因和EP364R基因順次串聯(lián)得到；所述D117L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述F317L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述EP364R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述第一連接基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；所述第二連接基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。

本發(fā)明還提供了一種含有上述方案所述基因的重組載體，所述重組載體以pShuttle-CMV載體為原始載體；所述基因的插入位點為KpnI和HindIII之間。

本發(fā)明還提供了一種重組腺病毒載體，插入有上述方案所述重組載體，插入位點為PmeI酶切位點序列的第一位點和第二位點之間；所述第一位點的核苷酸序列如SEQ IDNO：13所示；所述第二位點的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示。

本發(fā)明還提供了上述方案所述重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

使用限制性內(nèi)切酶PmeI對上述方案所述重組載體進行酶切，得到線性化質(zhì)粒，將所述線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入含pAdEasy-1質(zhì)粒的大腸桿菌中，經(jīng)過重組獲得重組腺病毒載體。

本發(fā)明還提供了一種包含上述方案所述重組腺病毒載體或者所述構(gòu)建方法得到重組腺病毒載體的重組腺病毒。

本發(fā)明還提供了上述方案所述重組腺病毒的構(gòu)建方法，包括以下步驟：將所述重組腺病毒載體經(jīng)過PacI酶切線性化，得到線性化質(zhì)粒，采用所述線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293A細胞進行培養(yǎng)，獲得重組腺病毒。

本發(fā)明還提供了上述方案所述重組腺病毒或所述構(gòu)建方法得到的重組腺病毒在制備非洲豬瘟疫苗中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種非洲豬瘟疫苗，包括免疫佐劑和免疫原，其特征在于，所述免疫原為上述方案所述重組腺病毒或所述構(gòu)建方法得到的重組腺病毒。