本發明屬于生物工程技術領域，涉及基因工程菌株的構建，尤其是一種重組大腸桿菌及其構建方法與應用。該重組大腸桿菌中敲除了磷酸十一碳烯基葡萄糖磷酸轉移酶基因wcaJ，重組表達了manB、manC、gmd、wcaG、srlD基因，還進一步重組表達了pntAB基因、ndK基因、gsK基因，并敲除了pfkA基因，從而增強了對山梨醇催化分解形成6?磷酸果糖的合成路徑，同時弱化了6?磷酸果糖的糖酵解過程，有助于6?磷酸果糖的積累，進而為GDP?L?巖藻糖的合成提供更多的前體物質；另外，對輔助因子NADPH和GTP的再生強化，有助于進一步提高重組大腸桿菌菌株生產GDP?L?巖藻糖的能力。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及基因工程菌株的構建，尤其是一種重組大腸桿菌及其構建方法與應用。

背景技術

鳥苷5'-二磷酸-L-巖藻糖(GDP-L-巖藻糖)作為一種L-巖藻糖的供體，是巖藻糖基化寡糖的生物合成過程中至關重要的底物。然而，GDP-L-巖藻糖的低生產水平和高成本限制了其在巖藻糖基寡糖的大規模生產中的應用。

在現有技術方案中，對于供體底物GDP-L-巖藻糖的生物合成目前已經確定有兩種途徑：從頭途徑(De novo pathway)和救助途徑(Salvage pathway)。

從頭合成途徑(De novo pathway)主要起源于細菌的中央代謝活動，GDP-L-巖藻糖的合成路徑主要以糖酵解中間產物6-磷酸果糖為起點，依次經過ManA(mannose6-phosphate isomerase，甘露糖-6-磷酸異構酶)，ManB(phosphomannomutase，磷酸甘露糖變位酶)，ManC(α-D-mannose-phosphate guanylyltransferase，α-D-甘露糖-磷酸鳥嘌呤基轉移酶)，Gmd(GDP-mannose-4,6-dehydratase，GDP-甘露糖4,6-脫氫酶)和WcaG(GDP-L-fucosesynthase，GDP-L-巖藻糖合成酶)五個酶促反應步驟，生成中間體GDP-L-巖藻糖。整個反應過程中，需要鳥苷5'-三磷酸(GTP)和NADPH作為輔因子。在此基礎上，只要外源引入特定的巖藻糖基轉移酶和受體糖底物，理論上就能催化合成所需的巖藻糖基化寡糖。另外，GDP-L-巖藻糖本身可以參與莢膜異多糖酸的生物合成，作為細胞壁的主要成分。

補救合成途徑(Salvage pathway)最初源于哺乳動物細胞和一些擬桿菌的代謝系統。該途徑從L-巖藻糖開始，胞外L-巖藻糖被轉移到細胞內，再依次通過L-巖藻糖激酶和GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶的催化作用合成GDP-L-巖藻糖。目前已經公開了一種來源于脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)的雙功能酶(Fkp)可以同時含有L-巖藻糖激酶活性和GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶活性，這無疑促進了GDP-L-巖藻糖代謝工程化合成的可行性。整個反應過程中，需要ATP和GTP作為輔因子。從合成路徑上看，補救合成路徑要相對簡單，但是所需要的底物L-巖藻糖極難獲得，且市場價格較高，因此該方案目前還不適合規模化的GDP-L-巖藻糖制備。

在野生型大腸桿菌中，通過葡萄糖的分解代謝就能合成GDP-L-巖藻糖，但受分解代謝物阻遏效應影響其生產水平有限，使得以葡萄代謝產生的GDP-L-巖藻糖僅供野生型大腸桿菌自身所需，而難以進行大量積累。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種利用山梨醇高產GDP-L-巖藻糖的重組大腸桿菌以及該重組大腸桿菌的構建方法，利用構建的重組大腸桿菌發酵合成GDP-L-巖藻糖為本發明的另一個目的。此外，本發明在高產GDP-L-巖藻糖的重組大腸桿菌的基礎上構建了一種利用山梨醇為碳源高產2’-巖藻糖基乳糖的工程菌株，并利用該工程菌株發酵合成2’-巖藻糖基乳糖。

基于上述目的，本發明采用如下技術方案：

第一方面，本發明構建了如下五種利用山梨醇高產GDP-L-巖藻糖的重組大腸桿菌。