[發(fā)明專利]用于環(huán)境的堿性磷酸酶活性的熒光檢測方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202011501476.5 | 申請日： | 2020-12-18 |
| 公開（公告）號： | CN112666143A | 公開（公告）日： | 2021-04-16 |
| 發(fā)明（設計）人： | 陳慶國;劉梅;楊金生;竺柏康 | 申請（專利權）人： | 浙江海洋大學 |
| 主分類號： | G01N21/64 | 分類號： | G01N21/64;C07F9/6558;C09K11/06 |
| 代理公司： | 北京國翰知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11696 | 代理人： | 周蕓蕓 |
| 地址： | 316002 浙江省舟*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 用于 環(huán)境 堿性磷酸酶 活性 熒光 檢測 方法 | ||
1.一種熒光探針的制備方法，包括：
S1：按質(zhì)量比為1：1.8～2.2取4-羥基-苯并[b]噻吩-7-羧醛、乙基苯并吲哚加入到體積比為7：2～4的正丁醇/甲苯的混合溶液攪拌溶解，加熱回流反應3～4h；
S2：反應結束后除去溶劑，在水和二氯甲烷的混合體系中靜置分層，有機相進一步純化，得到的熒光化合物Cy5-M；
S3：將得到的Cy5-M溶解在吡啶中，然后將三氯氧磷滴加到混合溶液中，室溫下攪拌反應0.5～1h后，加入水繼續(xù)攪拌反應0.5～1h；
S4：反應結束后除去溶劑，在二氯甲烷和水的混合液中進行萃取，保留水相，減壓濃縮、純化即得熒光探針CyP。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種熒光探針的制備方法，其特征在于：所述步驟S3中Cy5-M與三氯氧磷的固液比為1.6～1.8mg：1μL。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種熒光探針的制備方法，其特征在于：所述熒光探針的合成路線為：
4.權利要求1所述的熒光探針在檢測環(huán)境中堿性磷酸酶活性中的用途。
5.用于環(huán)境的堿性磷酸酶活性的熒光檢測方法，包括：
S1：將權利要求1所述的熒光探針與不同已知活性的堿性磷酸酶標準溶液在含有MgCl2的Tris-HCl buffer溶液中混合孵育，進行熒光光譜測試；
S2：利用堿性磷酸酶標準溶液活性和熒光光譜強度的線性關系，繪制標準曲線；
S3：將熒光探針和待測堿性磷酸酶溶液在含有MgCl2的Tris-HCl buffer溶液混合孵育，進行熒光光譜測試，得到待測堿性磷酸酶溶液的熒光光譜強度；
S4：利用步驟S2的標準曲線及步驟S3測得的熒光光譜強度，計算得到待測堿性磷酸酶活性。
6.根據(jù)權利要求5所述的用于環(huán)境的堿性磷酸酶活性的熒光檢測方法，其特征在于：所述步驟S1中堿性磷酸酶標準溶液的活性為0～300U/L。
7.根據(jù)權利要求5所述的用于環(huán)境的堿性磷酸酶活性的熒光檢測方法，其特征在于：所述步驟S1中熒光探針的濃度為18～23μM。
8.根據(jù)權利要求5所述的用于環(huán)境的堿性磷酸酶活性的熒光檢測方法，其特征在于：所述步驟S1中Tris-HCl buffer溶液的濃度為45～55mM，pH為7.5～8.5；所述MgCl2的濃度為0.5～1.5mM。
9.根據(jù)權利要求5所述的用于環(huán)境的堿性磷酸酶活性的熒光檢測方法，其特征在于：所述步驟S1和S3中孵育溫度為35～40℃時間為10～30min。
10.根據(jù)權利要求5所述的用于環(huán)境的堿性磷酸酶活性的熒光檢測方法，其特征在于：所述熒光檢測方法用于研究重金屬污染下的海水中金屬離子對ALP活性的影響。
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