1.一種高效產(chǎn)β-葡萄糖醛酸酶混合菌劑的制備方法，包括步驟一，新鮮動(dòng)物膽囊樣本采集；步驟二，大腸桿菌分離；步驟三，大腸桿菌鑒定；步驟四，大腸桿菌膽汁存活篩選；步驟五，膽酸多濃度梯度定向誘導(dǎo)培育；步驟六，牛膽囊仿生動(dòng)態(tài)模擬培育；步驟七，大腸桿菌β-G活性測(cè)定；步驟八，菌液混合培養(yǎng)；步驟九，動(dòng)物毒性試驗(yàn)檢測(cè)；其特征在于：

其中在上述步驟一中，人工無菌摘取雞、鴨、豬、牛等不同動(dòng)物膽囊；

其中在上述步驟二中，大腸桿菌分離包括以下步驟：

1)無菌條件下用一次性注射器采集膽囊內(nèi)膽汁0.1mL接種于伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基EMB，同時(shí)各取1mL膽汁接種于10mL，LB液體培養(yǎng)基以增菌；

2)分別置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)和37℃恒溫?fù)u床，培養(yǎng)16-24h，若EMB無菌落生長、LB清亮透明者視為無菌；

3)EMB無深紫紅色帶金屬光澤菌落但LB渾濁者，可再取0.1mL，LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接于EMB上37℃培養(yǎng)16-24h；若EMB上出現(xiàn)圓形、濕潤、光滑、邊緣整齊、中等大小的深紫紅色帶金屬光澤菌落視為可疑菌落，用無菌接種環(huán)挑取已編號(hào)的單個(gè)可疑菌落，于EMB培養(yǎng)基上進(jìn)行反復(fù)劃線分離以得到純化菌落；

其中在上述步驟三中，大腸桿菌鑒定包括以下步驟：

1)鏡檢，無菌挑取純化的單個(gè)可疑菌落，用革蘭氏染液染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察，鏡檢菌落形態(tài)為紅色短桿狀則初步判定為大腸桿菌；

2)PCR擴(kuò)增，將上一步驟判定為陽性的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；

其中在上述步驟四中，大腸桿菌膽汁存活篩選包括以下步驟：

1)將步驟三2)中判定為陽性的菌株用微量移液器吸取8μL，接種于1mL無菌處理后的新鮮牛膽汁中；

2)37℃培養(yǎng)30天后取8μL涂布于伊紅美蘭瓊脂平板，37℃培養(yǎng)，觀察是否有菌落生長，若有，則視為該菌株可在牛膽汁中存活；

其中在上述步驟五中，膽酸多濃度梯度定向誘導(dǎo)培育包括以下步驟：

1)使用5號(hào)膽鹽，膽酸含量70％-85％和無菌處理后的新鮮牛膽汁配成膽酸含量為12％、15％、18％、21％、24％、27％、30％的1mL無菌肉湯；

2)用無菌接種環(huán)挑取將步驟四2)中判定為陽性的菌落于1mL的12％膽酸-肉湯培養(yǎng)基中，取一環(huán)菌液接種于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上；

3)若觀察到有呈金屬光澤的綠色菌落，得到第一代菌株，然后將其置于膽酸含量為15％的膽酸-肉湯培養(yǎng)基中，重復(fù)上述步驟，將菌株馴化至能夠在含膽酸量為21％以上的無菌肉湯中存活且繁殖；

其中在上述步驟六中，牛膽囊仿生動(dòng)態(tài)模擬培育包括以下步驟：

1)模擬牛膽囊溫度的變化:設(shè)置溫度變化范圍：37℃、38℃、39℃、40℃、41℃，用無菌接種環(huán)挑取將上一步驟判定為陽性的菌株，接種于1mL無菌新鮮牛膽汁中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔8h上調(diào)溫度1℃，直至溫度達(dá)到41℃，每次上調(diào)前取一環(huán)菌液劃線于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h，檢測(cè)菌株生存活性；

2)模擬牛膽囊膽紅素濃度變化TBr：配置膽紅素溶液濃度范圍為0.1755mg/mL、0.2048mg/mL、0.2340mg/mL、0.2633mg/mL、0.2925mg/mL，用無菌接種環(huán)挑取將上一步驟判定為陽性的菌株接種于膽紅素-牛膽汁溶液中，每隔8h上調(diào)牛膽汁中膽紅素濃度，直至調(diào)節(jié)到0.2925mg/mL。每次上調(diào)前取一環(huán)菌液劃線于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h，檢測(cè)生存活性；

其中在上述步驟七中，大腸桿菌β-G活性測(cè)定包括以下步驟：

1)繪制對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線；

2)樣品處理：用無菌接種環(huán)挑取上一步驟生長最好的單菌落至20mLTSB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)6h后取出，調(diào)整菌液濃度為1×10⁸CFU/mL,在5000r/min、4℃條件下離心10min，棄去上清液，用PBS洗滌菌體2-3次，離心棄去上清液后向菌體加入3-4mL，PBS，用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)冰浴破碎30-45min，頻率為400HZ，5000r/min離心10分鐘，取上清液備用；

3)酶活性測(cè)定：吸取上清液80μl于96孔中，加入等量PNPG底物溶液，作為樣品液，36℃保溫1h；吸取80μl，PBS于96孔中，加入等量PNPG底物溶液，作為空白對(duì)照，36℃保溫1h；待各樣品保溫結(jié)束后，取出每孔加入36μl，0.1mol/L的NaOH溶液終止反應(yīng)，用全波長酶標(biāo)儀在405nm波長下用空白校正零點(diǎn)后測(cè)定樣品液的吸光度，將吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出對(duì)硝基酚濃度，然后按照下式計(jì)算酶的活性單位；其中在上述步驟八中，菌液混合培養(yǎng)包括以下步驟：

1)篩選出以1∶1濃度隨機(jī)兩兩配對(duì)混合后對(duì)于酶活性的作用為協(xié)同的大腸桿菌組合，再在這些組合中分別進(jìn)行1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、8∶1、4∶1、2∶1濃度配比；

2)混合培養(yǎng)后，測(cè)定混合菌液酶活力，并與同一組合1∶1濃度配比的混合菌液進(jìn)行酶活力對(duì)比，篩選出能夠高產(chǎn)β-G的混合菌液最佳配對(duì)及濃度配比；

其中在上述步驟九中，動(dòng)物毒性試驗(yàn)檢測(cè)包括以下步驟：

1)將篩選出能夠高產(chǎn)β-G酶的混合菌液的組合編號(hào)，取3周齡成年小鼠，每組6只，設(shè)置兩組分別于腹腔注射致病性大腸桿菌或生理鹽水，其余組分別于腹腔注射篩選出來的混合菌液，每只1×10⁹CFU/mL，試驗(yàn)飼養(yǎng)三周；

2)試驗(yàn)飼養(yǎng)三周，觀察篩選出來的菌種是否為非致病性大腸桿菌，結(jié)果表明為非致病性大腸桿菌的菌種保存?zhèn)溆谩?/p>