本發(fā)明提供一種細(xì)胞殺傷效力的評價方法。所述評價方法包括如下步驟：(1)將攜帶熒光標(biāo)記A的靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞共培養(yǎng)，再使用熒光標(biāo)記B對共培養(yǎng)后產(chǎn)生的死細(xì)胞進(jìn)行染色標(biāo)記，其中，熒光標(biāo)記A與熒光標(biāo)記B對應(yīng)的激發(fā)光波長不同；(2)分別使用明場、熒光標(biāo)記A匹配的熒光通道和熒光標(biāo)記B匹配的熒光通道對染色標(biāo)記后的細(xì)胞進(jìn)行顯微成像，得到顯微圖像；(3)對所得到的顯微圖像進(jìn)行疊加合成分析，根據(jù)分析結(jié)果評估所述效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞殺傷效力。本發(fā)明中，用熒光試劑A和熒光標(biāo)記B分別對靶細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行染色標(biāo)記，而后熒光顯微成像和圖像合成分析，能夠快速、直觀且準(zhǔn)確地得到細(xì)胞殺傷效力的評價結(jié)果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞殺傷活性檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)胞殺傷效力的評價方法。

背景技術(shù)

與目前的生物制品相比，免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品具有其獨(dú)特的特性，如起始個體差異大、制備工藝規(guī)模化程度低、制劑多為活細(xì)胞產(chǎn)品、作用機(jī)制不是很明確等，使得這類產(chǎn)品的一致性差、批量有限、效期短、同一類產(chǎn)品的可比性差等，這些特點(diǎn)均大大增加了質(zhì)量控制研究的難度，其中殺傷效力質(zhì)量控制便是難點(diǎn)之一。同時，在進(jìn)行病人的免疫水平評價，腫瘤治療愈后評價，以及細(xì)胞治療過程中的免疫細(xì)胞的增殖能力評價等環(huán)節(jié)中，也都需要對免疫細(xì)胞的殺傷能力進(jìn)行評估。

常用的細(xì)胞殺傷檢測方法有鎘51釋放實驗、乳酸脫氫酶(LDH)釋放法、BATDA法、CAM法、CytoTox-Glo法和PKH法等。其中經(jīng)典的方法是鎘51釋放實驗，該方法可重復(fù)性好，但是，因其使用同位素標(biāo)記靶細(xì)胞，從而存在半衰期短、同位素廢棄物處理及實驗防護(hù)要求高等多種限制因素，尤其是放射性同位素的使用對健康以及環(huán)境具有巨大威脅，其他放射性同位素標(biāo)記靶細(xì)胞如H3亦具有此類缺陷，使該類方法的應(yīng)用受到局限，因此，很多研究者會采用其它替代方法進(jìn)行生物學(xué)效力檢測。傳統(tǒng)的LDH法靈敏度及可重復(fù)性不穩(wěn)定，且所需時間較長，批間變異較大，不能適應(yīng)免疫細(xì)胞效期短的特點(diǎn)。

鎘51釋放實驗、LDH法、BATDA法和CytoTox-Glo法都屬于間接法，即先用某一試劑對靶細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，然后和不同濃度的免疫細(xì)胞進(jìn)行孵育，當(dāng)靶細(xì)胞受到免疫細(xì)胞的攻擊而損傷時，細(xì)胞膜通透性改變，這些物質(zhì)會釋放到上清中，通過測定釋放物質(zhì)的含量可以測定免疫細(xì)胞的活性。上述方法都是通過釋放物質(zhì)含量的測定而間接進(jìn)行定量，反應(yīng)時間的長短、儀器檢測的時間點(diǎn)都會對讀取的數(shù)值造成影響。

CAM法及PKH法是通過流式細(xì)胞儀檢測活細(xì)胞標(biāo)記及死亡標(biāo)記雙信號來反映其殺傷效率，與前述方法相比，這兩種方法所反映的信號還包括處于凋亡狀態(tài)的細(xì)胞。其中，流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)是一種在液流系統(tǒng)中快速測定單個細(xì)胞或細(xì)胞器的生物學(xué)性質(zhì)，并把特定的細(xì)胞或細(xì)胞器從群體中加以分類收集的技術(shù)。鑒于其在單細(xì)胞水平上高效準(zhǔn)確的定量分析優(yōu)勢，目前涌現(xiàn)出多種以流式細(xì)胞術(shù)為基礎(chǔ)的NK細(xì)胞殺傷活性的測定方法，但仍然存在缺陷。

由于效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞在共培養(yǎng)過程中，靶細(xì)胞對效應(yīng)細(xì)胞可能會產(chǎn)生一定抑制和破壞作用，則共培養(yǎng)體系的死亡率可能是包括靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的共同死亡率。流式分析的方法實驗階段需要根據(jù)經(jīng)驗調(diào)節(jié)電壓，數(shù)據(jù)分析階段需要根據(jù)經(jīng)驗進(jìn)行圈門，這樣的過程引入了操作人和分析人的主觀誤差。因此，盡管流式細(xì)胞術(shù)能夠特異性地檢測靶細(xì)胞的凋亡率，流式細(xì)胞儀屬于液流系統(tǒng)，無法采集到細(xì)胞圖像，若需要驗證結(jié)果的準(zhǔn)確性，還需要借助顯微鏡或其他儀器觀察進(jìn)行佐證。這導(dǎo)致流式的分析方法雖然在科研領(lǐng)域被廣泛的使用，但是在需要標(biāo)準(zhǔn)化可重復(fù)驗證的醫(yī)療診斷和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化領(lǐng)域難以廣泛使用。

因此，開發(fā)一種基于顯微圖像識別的、直觀可視地、準(zhǔn)確地評估細(xì)胞殺傷效力的方法，對于免疫細(xì)胞制品的研發(fā)或免疫細(xì)胞療法及臨床免疫評價的發(fā)展具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞殺傷效力的評價方法及其應(yīng)用。所述評價方法先通過對靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，區(qū)分活靶細(xì)胞、死靶細(xì)胞、活效應(yīng)細(xì)胞和死效應(yīng)細(xì)胞，并結(jié)合熒光顯微成像和圖像合成分析方法，根據(jù)對應(yīng)細(xì)胞個數(shù)計算得到細(xì)胞殺傷率。