本發明涉及生物細胞技術領域，具體涉及一種高純度通用型CAR?T的制備方法及應用。一種高純度通用型CAR?T的制備方法，所述通用型CAR?T的CAR的表達率為100％。本發明高純度通用型CAR?T的制備方法利用crispr?cas9技術敲除T細胞TCR的TRAC和HLA?I的B2M基因，以制備通用型CAR?T，并且使通用型CAR?T的CAR的表達率達到100％，減少輸注至人體中的CAR(?)TCR(?)T細胞量，從而降低不可知的風險。

技術領域

本發明涉及生物細胞技術領域，具體涉及一種高純度通用型CAR-T的制備方法及應用。

背景技術

近幾年來，腫瘤免疫療法發展迅速，尤其是過繼性細胞療法(ACT)，即指從病人體內分離出T細胞、NK細胞等免疫細胞，通過體外修飾擴增培養，隨后回輸入患者體內進行腫瘤治療的方法。2013年，腫瘤的免疫療法被Science雜質評為“十大突破”之首。

CAR-T和TCR-T是過繼性細胞療法重要的組成部分，尤其CAR-T療法，在血液腫瘤的治療上取得了顯著的成就，取得了較高的緩解率，典型的CAR結構由三部分組成，胞外識別腫瘤抗原的scFv、鉸鏈和跨膜結構域、胞內共刺激信號和激活結構域。第一代的CAR并不包含胞內共刺激信號，CAR-T細胞的殺傷活性較低且生存時間較短。因此，第二代CAR開始加入共刺激信號如CD28和4-1BB，采用不同的共刺激信號的CAR-T細胞的特性也不盡相同，CD28增強了CAR-T細胞的殺傷活性而4-1BB則增強CAR-T細胞殺傷活性的同時延長了CAR-T細胞的生存時間。隨后，出現了共同表達兩個共刺激信號域的三代CAR，然而其抗腫瘤效果并不如二代CAR-T。因此，現在臨床應的主要為二代CAR-T細胞。

CAR-T療法不僅在血液腫瘤的治療上成果顯著，而且商業化進展順利，美國FDA于2017年正式批準了兩種CAR-T藥品上市。盡管CAR-T細胞療法在血液腫瘤的治療上大放異彩，然而其制備成本高，需要用患者自己的血，需要患者等的時間久，尤其是對于癌癥晚期患者，時間是最寶貴的，并且由于病人體質，病情及之前用藥不同，一些病人的T細胞很難在體外擴增。因此，CAR-T在臨床上的應用大大受到了限制。臨床亟需off-the-shelf產品，是其真正市場化。

通用型CART技術極大程度上解決了以上問題，將是今后的一個方向。利用基因編輯技術ZFN(zinc-finger nucleases)、TALEN(transcription activator-like effectornucleases)和CRISPER-Cas等基因編輯技術，對健康供體來源的T細胞TCR及其他導致不同個體間免疫原性的基因的敲除，減少GvHD和HvGD，將會使CAR-T這一技術真正成為一種活的藥物，進而能夠廣泛而方便的供合適的患者使用，實現CAR-T細胞治療的產業化，并極大地降低成本。

然而，T細胞的TCR被敲除后，其依賴于TCR的對腫瘤細胞的殺傷能力無法實施，此時只能依靠轉入的CAR的激活來達到T細胞的殺傷，所以沒有轉入CAR的TCR(-)T細胞在體內起到的作用微乎其微，這就意味著輸給患者的通用型CAR-T制劑中含有部分無用的CAR(-)TCR(-)T。

公開于該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不應當被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

發明內容

針對上述問題，本發明的目的在于提供一種高純度通用型CAR-T的制備方法及應用，其利用crispr-cas9技術敲除T細胞TCR的TRAC和HLA-I的B2M基因，以制備通用型CAR-T，并且使通用型CAR-T的CAR的表達率達到100％，減少輸注至人體中的CAR(-)TCR(-)T細胞量，從而降低不可知的風險。

為實現上述目的，本發明提供了如下技術方案：

一種高純度通用型CAR-T的制備方法，所述通用型CAR-T的CAR的表達率為100％。