[發明專利]基于人羊膜及羊膜間充質干細胞的仿生羊膜及方法和應用有效
| 申請號： | 202010698210.8 | 申請日： | 2020-07-20 |
| 公開（公告）號： | CN111888529B | 公開（公告）日： | 2022-11-04 |
| 發明（設計）人： | 肖雁冰;韓磊;張婭 | 申請（專利權）人： | 肖雁冰;韓磊 |
| 主分類號： | C12N5/0775 | 分類號： | C12N5/0775;A61L27/40;A61L27/36;A61L27/38;A61L27/50 |
| 代理公司： | 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246 | 代理人： | 劉妮 |
| 地址： | 563003 貴州省遵義市*** | 國省代碼： | 貴州;52 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 基于 羊膜 間充質 干細胞 仿生 方法 應用 | ||
1.一種基于人羊膜及羊膜間充質干細胞的仿生羊膜，其特征在于，該仿生羊膜具有hAAM-AAM-hAAM的夾心結構，hAAM為人脫細胞羊膜，不含羊膜上皮細胞，hAAM的一面保留新鮮羊膜的呈纖維組織網狀交錯分布的三維結構，即上皮細胞下方的網狀纖維，另一面保留了新鮮羊膜原有的基底膜、致密層、纖維母細胞層和海綿層；AAM為通過羊膜間充質干細胞hAMSCs與BD基質膠制備的人工羊膜，兩個hAAM的網狀纖維面均處于內側，AAM處于兩個hAAM之間，且AAM中的hAMSCs通過細胞-基質連接結構定植于兩層hAAM的網狀纖維面的網孔中。
2.根據權利要求1所述的基于人羊膜及羊膜間充質干細胞的仿生羊膜，其特征在于，所述AAM的厚度為2~4mm。
3.根據權利要求1所述的基于人羊膜及羊膜間充質干細胞的仿生羊膜，其特征在于，所述AAM中，hAMSCs的細胞濃度為3~5×105/mL。
4.根據權利要求1所述的基于人羊膜及羊膜間充質干細胞的仿生羊膜，其特征在于，所述hAAM為通過將人新鮮羊膜組織依次經過戊二醛的交聯和胰蛋白酶的消化，使人新鮮羊膜組織的上皮層細胞松解、脫落率達80%以上而獲得的，其厚度為0.02~0.5mm。
5.一種如權利要求1-4中任意一項所述的基于人羊膜及羊膜間充質干細胞的仿生羊膜的制備方法，其特征在于，該方法包含：
將一片hAAM置于Transwell小室內底部，hAAM的網狀纖維面向上，在其上放置AAM，再將另一片hAAM覆蓋于在AAM上，且hAAM的網狀纖維面向下與AAM接觸，將Transwell小室置于加有相同培養基的孔板中，保證兩層hAAM和中間AAM在培養期間的營養條件，從而使AAM中的hAMSCs通過細胞-基質連接結構定植于兩層hAAM的網狀纖維面的網孔中，形成具有hAAM-AAM-hAAM夾心結構的膜，獲得基于人羊膜及羊膜間充質干細胞的仿生羊膜。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述AAM的制備為，用無血清的DMEM/F12培養基按1: 3稀釋BD基質膠，在冰浴中融化稀釋的BD基質膠，于冰浴中將hAMSCs與BD基質膠按1: 1混合注入孔板中，制成細胞濃度為3×105/mL的薄膜，在37℃培養使其成膠，加入適量DMEM/F12完全培養基，獲得AAM。
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，稀釋后的BD基質膠的濃度為50μL/cm2生長面積。
8.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述hAMSCs的提取為，將新鮮羊膜剪碎，加入0.25%胰蛋白酶消化，加入Ⅱ型膠原酶消化，收集細胞濾液并離心，重懸于含10%胎牛血清和100U/mL青鏈霉素的DMEM/F12培養基中，在37℃孵育；當細胞融合達到80%時，用0.25%胰蛋白酶消化，1: 3傳代培養，獲得3~5代生長狀態好的hAMSCs。
9.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述hAAM的制備為，將除雜后的人新鮮羊膜組織與戊二醛交聯，使用0.25%胰蛋白酶消化至上皮層細胞松解、脫落率達80%以上，去除多余的胰蛋白酶，獲得hAAM。
10.如權利要求1-4中任意一項所述的基于人羊膜及羊膜間充質干細胞的仿生羊膜的應用，其特征在于，該仿生羊膜用于制備宮腔內移植產品。
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