本發明提供一種葡萄糖脫氫酶電極及其制備方法和應用。通過化學手段將輔酶因子小分子NAD⁺非活性部位進行化學修飾，將化學修飾后的NAD⁺與殼聚糖載體共價連接得到NAD⁺?殼聚糖復合物，再在基底電極表面修飾碳納米管，利用碳納米管作為基底材料，用于NADH的檢測；在電極上電沉積ABTS，使用ABTS作為電子媒介體實現NAD⁺原位再生；滴加NAD⁺?殼聚糖復合物，實現NAD⁺在電極表面的固定；通過戊二醛交聯作用將脫氫酶酶連接到殼聚糖載體上，得到脫氫酶電極；該NAD⁺的固定化與再生方法可與不同種類脫氫酶結合，制備多種脫氫酶電極/生物傳感器。本發明在生物傳感器制備領域具有廣泛的實際應用價值。

本申請為申請號2020101521251、申請日2020年3月6日、發明名稱“一種輔酶因子復合物、酶電極、酶傳感器及其制備方法和應用”的分案申請。

技術領域

本發明屬于檢測分析技術領域，具體涉及一種葡萄糖脫氫酶電極及其制備方法和應用。

背景技術

公開該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已經成為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

氧化還原酶類是自然界品種最豐富的一類酶，在酶的六大類型中，30％～35％為氧化還原酶。氧化酶依賴性生物傳感器是成熟的發展產物，但也存在一些缺點，如氧化酶在作用過程中需要消耗氧氣，易受O₂的干擾；氧化酶反應產物多為H₂O₂，H₂O₂積累會對傳感器檢測造成影響。脫氫酶在自然界中更為豐富，現報道的自然界脫氫酶已近400種之多。脫氫酶生物傳感器依托輔酶完成反應，輔酶可直接參與反應，不受O₂干擾，反應更靈敏、快速。因此，脫氫酶生物傳感器成為研究熱點，在醫藥檢測、食品發酵控制等方面發揮重要作用。M.Gamellaa等人通過制備蘋果酸脫氫酶電化學生物傳感器監測葡萄酒釀造過程中的蘋果酸-乳酸發酵過程。Vinay Narwal等用通過制備乳酸脫氫酶納米顆粒修飾的金電極測定乳酸鹽。梁云玉等人研制了谷氨酸脫氫酶伏安傳感器，用于敏感的銨離子測定。

大部分脫氫酶催化作用的發揮需要煙酰型輔酶[NAD⁺，NADH]的參與，它在酶促反應中與酶結合，并作為氧化劑或還原劑直接參與反應。煙酰型輔酶中，NAD⁺為氧化態，NADH為還原態，氧化態輔酶和還原態輔酶通過加氫或脫氫的氧化還原反應相互轉化。NAD⁺在執行電子傳遞功能時不被酶分子包裹于內部。因此，傳統的脫氫酶電極需要通過在反應體系中添加游離NAD⁺實現脫氫酶與底物的反應。但是游離NAD⁺無法重復使用，每次測定時需要重復添加游離NAD⁺。NAD⁺的價格昂貴，通常比酶促反應所得產物要貴得多，其價格需要大約＄100/g。加入游離NAD⁺還存在耗時長、操作復雜等缺點，不利于脫氫酶電極的方便使用和推廣。對輔酶NAD⁺進行固定化并再生循環使用是很有必要的。輔酶NAD⁺在電極表面的固定和有效再生技術是構建脫氫酶電極/傳感器的兩個關鍵技術。脫氫酶電極NAD⁺只有幾百個分子量，傳統方法很難對其進行固定，要將其包埋在半透膜中比較困難，若將輔酶與高分子載體結合，使其高分子化可以解決這一難題。實現脫氫酶電極循環使用的另一個關鍵問題是NAD⁺的再生。然而，發明人發現，NADH的氧化過電位較高，電子傳遞速率過慢、動力學特征不理想，會在電化學氧化過程中生成二聚體沉積在電極表面使電極鈍化，從而使NADH的直接測定和NAD⁺的再生變得十分困難，基于電子媒介體的氧化還原再生NAD⁺是一種有效的再生方法，可以降低NADH氧化電位，提高電極表面電子傳遞速率，實現脫氫酶電極使用過程中的NAD⁺再生。

發明內容