本發(fā)明提供了一種全人源化具有中和破傷風(fēng)類毒素的三價(jià)特異性抗體，該三價(jià)特異性抗體由單鏈I和II組成，每單鏈均都包含了2個(gè)單鏈可變片段(scFv)、1個(gè)人的IgG1的鉸鏈區(qū)和1個(gè)Fc片段，這四個(gè)單鏈可變片段(scFv)是由分別命名為A、B和兩個(gè)C片段組成，均可以分別發(fā)揮中和作用。該三價(jià)特異性抗體采取在同一株畢赤酵母表達(dá)，并用糖苷酶處理純化后的產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)小鼠中和實(shí)驗(yàn)表明具有保護(hù)作用，該抗體具有藥學(xué)和作為診斷試劑用途。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開(kāi)了一種全人源化中和抗破傷風(fēng)毒素的三價(jià)特異性抗體及其制備方法。

背景技術(shù)

破傷風(fēng)是由破傷風(fēng)桿菌入侵創(chuàng)傷而引起的一種特異性感染，其主要致病原是破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)生的破傷風(fēng)類毒素。破傷風(fēng)類毒素是一個(gè)由1315個(gè)氨基酸組成的分子量約為150kDa蛋白。該蛋白在破傷風(fēng)桿菌的蛋白水解酶作用后，在456和467氨基酸殘基之間裂解成為分量大約為50KD輕鏈(LC)和100KD重鏈(LN)，LC和LN通過(guò)一對(duì)二硫鍵S439-S467連接。在864和863之間有一個(gè)木瓜蛋白酶(papin)切位點(diǎn)可以將重鏈進(jìn)一步降解為N端(HCN)和C端(HCC或TTC)。HCN負(fù)責(zé)突觸囊泡通過(guò)細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的膜，而TTC負(fù)責(zé)毒素結(jié)合神經(jīng)元細(xì)胞。在TTC一段有兩個(gè)區(qū)域發(fā)揮結(jié)合神經(jīng)元的受體，一是以Trp1289、His1271和Try1290為核心所形成的W pocket，二是以Asp1147、Arg1226、Asn1216、Asp1214和Try1229為核心區(qū)域的R pocket，以往的文獻(xiàn)證明，能夠封閉這兩個(gè)位點(diǎn)的抗體可以有效地發(fā)揮保護(hù)作用。

破傷風(fēng)治療方法最有效的是注射破傷風(fēng)抗毒素(TAT)、馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab)₂或人破傷風(fēng)免疫球蛋白(TIG)。破傷風(fēng)抗毒素(TAT)和馬破傷風(fēng)免疫球蛋白均是用破傷風(fēng)類毒素免疫馬匹所制得的抗毒素，其形式有所差異的，這兩種形式的抗毒素來(lái)源于馬匹，有一定程度過(guò)敏反應(yīng)，而人破傷風(fēng)免疫球蛋白(TIG)是破傷風(fēng)類毒素免疫人體所制得的抗毒素，雖然無(wú)過(guò)敏性但具有較昂貴、來(lái)源少、制備復(fù)雜、供應(yīng)不足等等缺點(diǎn)。我國(guó)臨床上廣泛使用的仍為TAT，只有在TAT過(guò)敏試驗(yàn)陽(yáng)性或者家屬主動(dòng)要求的情況下才會(huì)使用TIG。人們希望找到一種無(wú)過(guò)敏性且價(jià)格低廉的完全人特異性抗體，可以替代目前的抗體來(lái)源。

隨著雜交瘤單克隆技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)以來(lái)，人們逐漸在該領(lǐng)域中使用這些技術(shù)進(jìn)行研究，但是這些研究仍存在的一些問(wèn)題：①篩選到的序列未進(jìn)行克隆表達(dá)，僅做了序列分析；②克隆表達(dá)的序列僅僅進(jìn)行了體外ELLISA和(或)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)，未知體內(nèi)的保護(hù)作用；③有的序列表達(dá)后進(jìn)行了小鼠體內(nèi)中和保護(hù)實(shí)驗(yàn)，一種常見(jiàn)的思路就是多種單抗混合類似“雞尾酒”方式，這種思路方案有兩種方案，一是分別表達(dá)單抗，再混合；一是混合表達(dá)單抗。前者是重組單抗的生產(chǎn)成本兩倍以上，不具有生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。而后者具有產(chǎn)物純度低和得率低導(dǎo)致成本很高的缺點(diǎn)。

畢赤酵母Pichia pastoris目前已是僅次于大腸桿菌的最常用蛋白表達(dá)系統(tǒng)，被美國(guó)FDA認(rèn)定為GRAS(Generally recognized as safe)微生物，具備其他系統(tǒng)不具備的特點(diǎn)，如甲醇利用、高密度發(fā)酵、副產(chǎn)物少等，但是畢赤酵母可使蛋白嚴(yán)重o-糖基化，導(dǎo)致了人體的免疫反應(yīng)，因此很少用于抗體表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是在于提供一種全人源化的抗破傷風(fēng)三價(jià)特異性抗體，該抗體具有中和破傷風(fēng)毒素的功能。

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是在于提供一種大量生產(chǎn)低價(jià)且免疫性低的三價(jià)特異性抗體的制備方法。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取了如下的技術(shù)方案：

技術(shù)方案之一，前期的工作獲得了A、B和C三個(gè)ScFV(單鏈可變片段)序列，在畢赤酵母中表達(dá)后，分別具有中和作用，進(jìn)一步采取混合的方法檢測(cè)，結(jié)果顯示混合的ScFV具有協(xié)同保護(hù)作用。