本發明公開了一種肝細胞體外共培養體系及其構建方法與應用。一種肝細胞體外共培養體系，包括細胞外基質、肝細胞以及3T3?J2成纖維細胞；所述的肝細胞種于所述的細胞外基質上，所述的肝細胞表面鋪有所述的3T3?J2成纖維細胞。所述的肝細胞體外共培養體系的構建方法如下：將3T3?J2成纖維細胞接種在溫度敏感性培養皿上，培養，剝離，得到。本發明提供的肝細胞體外共培養體系為人類肝細胞提供了一個更接近于體內肝組織微環境的立體形態，保證了緊密的肝細胞/肝細胞相互連接及肝細胞/支持細胞的相互作用，可以有效增強并維持肝細胞功能，進而可以用于長期藥物評估。

技術領域

本發明屬于細胞培養技術領域，具體涉及一種肝細胞體外共培養體系及其構建方法與應用。

背景技術

藥物性肝損傷是導致藥物研發失敗以及藥物上市后被撤回的重要原因。由于動物與人的種屬差異性，動物模型并不能保證準確預測藥物在人體內的肝毒性。因此，建立穩定可靠的體外人類原代肝細胞模型并用于預測藥物的肝毒性尤為重要。然而，人類原代肝細胞在普通二維體外培養過程中，由于缺乏體內肝臟的三維結構、細胞間相互作用以及生長因子的支持，會快速失去正常的形態和功能，從而導致肝細胞的藥物代謝功能降低，進而影響其用于藥物肝毒性篩選評估。因此，長期維持肝細胞的藥物代謝功能是建立人類肝細胞模型所需要考慮的重要問題。

發明內容

為了克服現有肝細胞在二維體外培養過程中存在快速失去正常的形態和功能從而導致肝細胞的藥物代謝功能降低的問題，本發明第一個方面的目的，在于提供一種肝細胞體外共培養體系。

本發明第二個方面的目的，在于提供上述肝細胞體外共培養體系的構建方法。

本發明第三個方面的目的，在于提供一種包括上述肝細胞體外共培養體系的試劑盒。

本發明第四個方面的目的，在于提供上述肝細胞體外共培養體系的應用。

為了實現上述目的，本發明所采取的技術方案是：

本發明的第一個方面，提供一種肝細胞體外共培養體系，包括細胞外基質、肝細胞以及3T3-J2成纖維細胞；所述的肝細胞種于所述的細胞外基質上，所述的肝細胞表面鋪有所述的3T3-J2成纖維細胞。

所述的細胞外基質包括膠原、基質膠在內的所有天然類及合成類的細胞外基質；優選為膠原蛋白；更優選為鼠尾腱Ⅰ型膠原蛋白。

所述的肝細胞優選為永生化細胞系、原代細胞、衍生自多能干細胞中的至少一種；更優選為原代細胞。

所述的肝細胞的來源優選為人。

所述的3T3-J2成纖維細胞優選為3T3-J2成纖維細胞薄片。

所述的3T3-J2成纖維細胞薄片優選通過如下步驟得到：將3T3-J2成纖維細胞接種在溫度敏感性培養皿上，培養，剝離，得到3T3-J2成纖維細胞薄片。

所述的3T3-J2成纖維細胞的接種數優選為120萬～240萬；更優選為150萬～200萬。

所述的溫度敏感性培養皿優選為預涂胎牛血清的溫度敏感性培養皿。

所述的預涂胎牛血清的溫度敏感性培養皿優選通過如下方法得到：取胎牛血清加入溫度敏感性培養皿，36～38℃過夜涂層，得到。

所述的培養優選依次包括第一次培養和第二次培養。

所述的第一次培養的條件優選為35～39℃、3％～7％CO₂濃度下培養3～5天；更優選為36～38℃、4％～6％CO₂濃度下培養3.5～4.5天；最優選為37℃、5％CO₂濃度下培養4天。

所述的第二次培養的條件優選為18～22℃下培養0.5～2.5h；更優選為20℃下培養1h-2h。