本發明提供了一種測定土壤脂肪酸甲酯的定量方法及其應用，本發明利用37種脂肪酸甲酯混合標準品作為外標，在GC?MS上確定運行參數，建立測定脂肪酸甲酯的方法，采用十九烷酸甲酯內標和37種脂肪酸甲酯外標的混合溶液確定外標中脂肪酸甲酯的校正因子，提取土壤中磷脂脂肪酸并進行甲酯化，結合外標中脂肪酸甲酯的保留時間和NIST譜庫檢索，對待測樣品中碳原子數為9?19的脂肪酸甲酯進行類型的定性分析，利用前述所得外標中脂肪酸甲酯的校正因子并結合待測脂肪酸甲酯的化學結構確定樣品中碳原子數為9?19的脂肪酸甲酯的校正因子，最后通過得出的校正因子計算土壤中碳原子數為9?19的脂肪酸甲酯的含量，從而實現對土壤微生物群落結構更準確的表征。

技術領域

本發明涉及化學領域，尤其涉及化合物檢測技術，特別涉及氣相色譜-質譜聯用儀檢測化合物的技術，具體來說是一種檢測土壤中脂肪酸甲酯的定量方法及其應用。

背景技術

磷脂脂肪酸(PLFAs)是細胞膜的組成成分之一，由于不同種類微生物所含有的PLFAs的種類不同，利用PLFAs的組成來表征土壤微生物群落結構已被廣泛應用。為了提高待測物質的穩定性以及降低其沸點使其更容易氣化，一般需要將PLFAs衍生化為相應的甲酯，即脂肪酸甲酯FAME，然后測試其成分和含量。測定FAME的常用儀器包括氣象色譜儀、氣相色譜-質譜聯用儀、液相色譜-質譜聯用儀，其中，美國MIDI公司開發的SherlockMicrobial Identification System(MIS)就是在氣象色譜儀的平臺上(如Agilent公司的GC-6850,7820,6890和7890)對微生物中特定短鏈脂肪酸(C9-C20)形成FAME的種類和含量進行鑒定和分析的軟件。盡管利用該軟件能對大批量樣品進行快速檢測，但仍存在數據庫中缺少待檢測的FAME以及色譜峰誤判的情況，并且購買MIDI軟件的費用相對比較昂貴。液相色譜-質譜聯用儀能夠分析FAME的極性磷酸頭部，也能夠分析FAME的非極性脂肪酸側鏈，能展示最初活體細胞膜磷脂分子所承載的全部信息。但是，由于目前尚沒有商業化的譜庫可供用戶檢索，其在FAME檢測方面的應用還不夠廣泛。氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)用于檢測FAME具有高的靈敏度、低檢測限，并且具有商業化的NIST譜庫可供檢索，具有良好的應用前景。

目前，對FAME進行定量的方法主要包括面積歸一化法、內標法、外標法等。面積歸一化法是在所有組分的校正因子相同的條件下，將待測樣品所有出峰組分的含量按100％計，根據響應值計算每個組分的百分含量。這種方法計算簡便，并且能消除因儀器狀態和運行條件的差異而帶來的誤差。但是，該方法不能得到待測組分的絕對含量。內標法直接使用待測組分和內標(一般為十九烷酸甲酯)的響應值(峰面積或峰高)的比值以及內標的含量確定待測組分的含量，但是沒有考慮不同FAME對儀器的響應存在差異。外標法則是通過建立標準曲線來計算樣品中待測FAME的含量。但是，由于目前市場上銷售的FAME混合標準品不能包含從土壤中所提取的全部目標FAME，該方法不能對土壤所特有的FAME進行準確定量。

任慧琴等(2014)發表的文章“土壤微生物群落結構分析中磷脂脂肪酸法和溫和堿性甲酯化法的比較及定量優化”(環境化學,33(5):760-764)分別使用“內標對比法”(同時使用內標和外標)和“直接計算法”(依據樣品含量和峰面積呈正比的原理)兩種方法對土壤FAME進行定量，發現兩者存在差異，進而通過兩者的比值計算出校正系數，并對只能用于“直接計算法”的組分進行校正，使得沒有標準品的FAME仍能定量，優化了利用GC-MS測定FAME的定量方法。然而，該方法仍然存在以下不足：第一，雖然“內標對比法”考慮了不同FAME對GC-MS的響應不同，但用于定量的公式默認樣品中和內外標混合溶液中內標的質量相同，限制了公式的應用；第二，外標中沒有包含的FAME的校正因子，使用的是已知的所有FAME的校正因子的平均值，平均化處理在某種程度上會使誤差增大。因此，有必要進一步優化土壤脂肪酸甲酯的定量方法。

發明內容

本發明的主要目的在于，克服現有技術中的不足，建立一種測定土壤脂肪酸甲酯的定量方法及其應用，從而實現對土壤微生物群落結構更準確的表征。