[發明專利]集成循環腫瘤細胞分離及單細胞免疫印跡的微流控芯片有效
| 申請號: | 202010558730.9 | 申請日: | 2020-06-18 |
| 公開(公告)號: | CN111733056B | 公開(公告)日: | 2022-09-27 |
| 發明(設計)人: | 丁顯廷;阿依努爾·阿卜拉;張婷;謝海洋 | 申請(專利權)人: | 水熊健康科技(南通)有限公司 |
| 主分類號: | C12M1/00 | 分類號: | C12M1/00;C12M1/42;C12M1/12;G01N33/68;B01L3/00 |
| 代理公司: | 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220 | 代理人: | 鄭立 |
| 地址: | 226126 江蘇省南通*** | 國省代碼: | 江蘇;32 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 集成 循環 腫瘤 細胞 分離 單細胞 免疫 印跡 微流控 芯片 | ||
1.一種集成循環腫瘤細胞分離及單細胞免疫印跡的微流控芯片,其特征在于,包括循環腫瘤細胞分選單元、單細胞捕獲單元、光活性凝膠電泳分離單元和免疫印跡分析單元,所述循環腫瘤細胞分選單元的末端與所述單細胞捕獲單元的前端相通,所述單細胞捕獲單元的末端設有光活性凝膠電泳分離單元和免疫印跡分析單元,所述光活性凝膠電泳分離單元和所述免疫印跡分析單元共有凝膠,所述循環腫瘤細胞分選單元被設置為將細胞樣本中的循環腫瘤細胞分離分選出來,所述單細胞捕獲單元被設置為將分選富集后的細胞實現單細胞的捕獲,并在細胞捕獲后對細胞進行封閉裂解,所述光活性凝膠電泳分離單元被設置為將細胞裂解后的蛋白推進到芯片上的凝膠涂層區域,通過施加電場使得蛋白根據分子量不同在凝膠中分離,所述免疫印跡分析單元被設置為通過特異性的抗體孵育和洗脫,對靶蛋白分子進行熒光或發光基團標記并檢測其信號。
2.如權利要求1所述的微流控芯片,其特征在于,所述循環腫瘤細胞分選單元包含微流控通道,所述微流控通道采用蛇形設計,所述微流控通道的輸入管道的直徑為0.15~0.3mm,外側輸出管道的直徑為5~10mm。
3.如權利要求1所述的微流控芯片,其特征在于,所述循環腫瘤細胞分選單元的末端設有過濾膜,所述過濾膜的孔徑尺寸根據待分離的循環腫瘤細胞的尺寸進行調整。
4.如權利要求1所述的微流控芯片,其特征在于,還包括細胞阱,所述細胞阱設置在所述單細胞捕獲單元和所述光活性凝膠電泳分離單元之間,所述細胞阱的直徑尺寸根據待分離的循環腫瘤細胞的尺寸進行調整。
5.一種利用微流控芯片進行循環腫瘤細胞的分離及單細胞免疫印跡的方法,其特征在于,包括如下步驟:
(1)將血液樣本進行紅細胞裂解的預處理,離心后用大體積PBS或生理鹽水稀釋重懸,
(2)將經過預處理的細胞樣本經由如權利要求1所述的微流控芯片上的微流控通道在循環腫瘤細胞分選單元中進行分選,
(3)純化與濃縮循環腫瘤細胞,
(4)循環腫瘤細胞的單細胞捕獲和裂解,細胞在分選后會被單細胞捕獲單元引入細胞阱中,最終達成單個細胞均勻入阱和裂解,
(5)凝膠電泳,細胞在裂解后,在芯片兩端施加電場,蛋白在電場的作用下進入芯片表面的凝膠涂層中開始電泳分離,
(6)蛋白質的光敏固定,凝膠電泳結束后,通過對凝膠表面進行激發光照射,使凝膠涂層蛋白條帶中蛋白分子和凝膠單體分子原位聚合,而后進行免疫印跡蛋白分析,將固定好的蛋白分子用特異性的一抗及帶有熒光或發光基團標記的二抗識別結合,
(7)在激光共聚焦熒光顯微鏡下,測定目標蛋白分子的熒光信號強度。
6.如權利要求5所述的方法,其特征在于,步驟(3)的純化與濃縮是采用過濾膜,所述過濾膜的孔徑尺寸可以根據待分離的循環腫瘤細胞的尺寸進行調整。
7.如權利要求5所述的方法,其特征在于,步驟(5)的電場為40V/cm,步驟(6)中的激發光的波長為320-360nm,凝膠電泳結束后,所述凝膠經所述激發光照射60s。
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