[發明專利]一種分離、提純及鑒定壞死桿菌外膜囊泡的方法在審
| 申請號： | 202010414920.3 | 申請日： | 2020-05-15 |
| 公開（公告）號： | CN111440748A | 公開（公告）日： | 2020-07-24 |
| 發明（設計）人： | 孫東波;郭東華;趙鵬宇;李春秋;蔣劍成 | 申請（專利權）人： | 黑龍江八一農墾大學 |
| 主分類號： | C12N1/20 | 分類號： | C12N1/20;C12N1/02;G01N33/569;A61K39/02;A61P31/04;C12R1/01 |
| 代理公司： | 西安研創天下知識產權代理事務所(普通合伙) 61239 | 代理人： | 楊鳳娟 |
| 地址： | 163319 黑*** | 國省代碼： | 黑龍江;23 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 分離 提純 鑒定 壞死 桿菌 外膜囊泡 方法 | ||
1.一種分離、提純及鑒定壞死桿菌外膜囊泡的方法，其特征在于，包括以下步驟：
S1.培養壞死桿菌
將壞死桿菌A25菌株接于苛氧肉湯液體培養基中復蘇，在37℃，90％N2、5％CO2、5％H2的厭氧培養箱內靜置培養，傳2-3代后作為種子液以1:25的比例轉接于腦心浸液肉湯液體培養基中，在OD600值為0.7-0.9時收獲菌液，得到培養后的壞死桿菌；
S2.提取和純化壞死桿菌外膜囊泡
將步驟一培養的壞死桿菌進行離心、收集上清液、過濾、稀釋等步驟提取得到純化后的壞死桿菌外膜囊泡；
S3.壞死桿菌外膜囊泡組分分析與鑒定
采用Label-free非標記定量蛋白質組學方法分析壞死桿菌外膜囊泡的成分，得到蛋白質鑒定及定量分析結果；
S4.對得到的壞死桿菌外膜囊泡進行特異性免疫實驗。
2.根據權利要1所述的一種分離、提純及鑒定壞死桿菌外膜囊泡的方法，其特征在于，步驟S2所述的提取和純化OMVs的具體步驟為：
S2.1將壞死桿菌菌液在4℃，8500×g，離心15min，收集離心后的上清液，將收集的上清液用0.22μm的濾膜過濾，收集濾液；
S2.2將濾液移至無菌超速離心管中，在4℃，213000×g，離心2h，棄去上清液，將沉淀用無菌PBS懸?。?/p>
S2.3用pH7.4含有10mM Tricine-NaOH的0.85％NaCl溶液，將60％OptiPrep稀釋至35％、30％、25％、20％，用懸浮的壞死桿菌外膜囊泡將60％OptiPrep稀釋到濃度為40％，取40％OptiPrep稀釋液置于Ultra-Clear離心管底部，依次向上加入濃度為35％、30％、25％、20％的OptiPrep稀釋液，并在4℃，135000×g，離心16h；
S2.4離心后，從上至下依次吸取不同濃度的OptiPrep稀釋液，然后從中取10μL不同濃度的OptiPrep稀釋液進行SDS-PAGE，分析不同濃度的OptiPrep稀釋液中壞死桿菌外膜囊泡的含量，不同濃度OptiPrep稀釋液的SDS-PAGE結果顯示，隨著OptiPrep稀釋液濃度的增加，條帶變淺；
S2.5用無菌PBS將不同濃度的OptiPrep稀釋液稀釋至少十倍，并在4℃，200500×g，離心2h，去除上清液，將離心后沉淀重懸于無菌PBS中，-80℃保存備用，進行透射電子顯微鏡觀察。
3.根據權利要2所述的一種分離、提純及鑒定壞死桿菌外膜囊泡的方法，其特征在于，步驟S3所述的壞死桿菌外膜囊泡組分分析與鑒定的包括采用Label-free非標記定量蛋白質組學方法分析壞死桿菌外膜囊泡的成分分析過程S3.1和壞死桿菌外膜囊泡中43K OMP和lktA的Western Blot驗證過程S3.2。
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