[發明專利]一種真核細胞單堿基基因編輯的引物、試劑盒及使用方法、用途在審

申請號：	202010368642.2	申請日：	2020-05-01
公開（公告）號：	CN111518838A	公開（公告）日：	2020-08-11
發明（設計）人：	黃嘯	申請（專利權）人：	山東瑞輯通慧生物技術有限公司
主分類號：	C12N15/90	分類號：	C12N15/90;C12N15/11
代理公司：	北京智宇正信知識產權代理事務所(普通合伙) 11876	代理人：	李明卓
地址：	261000 山東省濰坊***	國省代碼：	山東;37
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種真核細胞堿基基因編輯引物試劑盒使用方法用途
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【權利要求書】：

1.一種用于真核細胞單堿基基因編輯的引物，其特征在于，包括后端引物如下(1)或(2)：

(1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)為SEQ ID NO.1所示核苷酸序列經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸。

2.根據權利要求1所述的引物，其特征在于，包括前端引物，前端引物從5’端到3’端包括啟動子序列、靶基因特異性sgRNA序列、和與后端引物3’端部分堿基互補的序列。

3.根據權利要求2所述的引物，其特征在于，所述啟動子序列為SP6啟動子，長度為19bp；靶基因特異性sgRNA序列長度為19～22bp；與后端引物互補序列長度為21bp。

4.一種真核細胞單堿基基因編輯的試劑盒，包括權利要求1-3任一項所述的引物。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，包括獨立包裝的ABE mRNA溶液和/或CBEmRNA溶液。

6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述ABE mRNA溶液的濃度為1～5μg/μL；所述CBE mRNA溶液的濃度為1～5μg/μL。

7.根據權利要求4-6任一項所述的試劑盒，其特征在于，包括獨立包裝的Enzyme Mix和/或2×反應緩沖液；

所述Enzyme Mix包括DNA聚合酶，RNA聚合酶和/或RNase抑制劑；

所述2×反應緩沖液包括醋酸鉀，Tris-Acetate，醋酸鎂，BSA和/或后端引物。

8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述Enzyme Mix中DNA聚合酶為0.2～2Unit/μL，RNA聚合酶為0.2～2Unit/μL，和RNase抑制劑為0.2～2Unit/μL。

9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述DNA聚合酶選自但不限于：Klenow聚合酶、Taq酶、Pfu酶、Q5酶中的任意一種；所述RNA聚合酶選自但不限于：T7 RNA聚合酶、Sp6RNA聚合酶、U6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶中的任意一種；所述RNase抑制劑選自但不限于鼠源RNase抑制劑或市販RNase抑制劑的任意一種。

10.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述2×反應緩沖液中，醋酸鉀濃度為40～100mM，Tris-Acetate濃度為20～40mM，醋酸鎂濃度為10～20mM，BSA濃度為100～200μg/ml。

11.根據權利要求7或10所述的試劑盒，其特征在于，所述2×反應緩沖液中還包括dNTPs和NTPs，所述dNTPs濃度為100～200μM，所述NTPs濃度為0.5～1mM。

12.根據權利要求7或10或11所述的試劑盒，其特征在于，所述2×反應緩沖液中還包括后端引物，濃度為100～200μM。

13.一種真核細胞單堿基基因編輯的方法，其特征在于，包括利用權利要求1-3任一項所述的引物和/或權利要求4-12任一項所述的試劑盒。

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