本發(fā)明提供了一種針對(duì)正鏈RNA病毒的單質(zhì)粒拯救系統(tǒng)及基于該系統(tǒng)的塞內(nèi)卡病毒感染性克隆及構(gòu)建方法和應(yīng)用，涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了針對(duì)正鏈RNA病毒的單質(zhì)粒拯救系統(tǒng)以及利用該拯救系統(tǒng)可定向設(shè)計(jì)SVA反向重組疫苗及構(gòu)建SVA定向突變毒株在病毒基因功能、病毒變異及致病機(jī)制等研究中的應(yīng)用。本發(fā)明利用聚合酶I和聚合酶II啟動(dòng)子、終止子、核酶等元件構(gòu)建的單質(zhì)粒塞內(nèi)卡病毒拯救系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了在質(zhì)粒水平上編輯病毒基因組，為病毒定向設(shè)計(jì)、構(gòu)建和拯救提供了技術(shù)平臺(tái)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于單質(zhì)粒拯救系統(tǒng)的塞內(nèi)卡病毒感染性克隆及構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

塞內(nèi)卡病毒A(SenecavirusA,SVA)，也稱塞內(nèi)卡病毒(Senecavirus)、塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)，屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)塞內(nèi)卡病毒屬(Senecavirus)，也是該屬的唯一成員。該病毒感染豬能夠引起豬的原發(fā)性水泡病，與口蹄疫、豬水泡病和水泡性口炎等引起的臨床癥狀難以區(qū)分。SVA感染后能引起斷奶仔豬、保育、育肥和繁殖的各年齡段的豬發(fā)生水泡性病變，同時(shí)伴隨跛行、發(fā)熱、厭食、嗜睡等臨床癥狀，新生仔豬除了上述癥狀外，還可能存在持續(xù)的腹瀉、脫水等癥狀，甚至?xí)蝗凰劳觥?/p>

塞內(nèi)卡病毒先后在美國(guó)、加拿大、巴西、哥倫比亞、中國(guó)、泰國(guó)等多個(gè)國(guó)家引發(fā)疫情，2015年傳入我國(guó)，首次在廣東出現(xiàn)疫情，并迅速擴(kuò)散，在福建、廣西、湖北、河南、河北、山東、遼寧等省均引起大量豬場(chǎng)發(fā)病，傳播速度和致病力均比此前報(bào)道的有所增強(qiáng)，且有研究表明目前我國(guó)SVA流行毒株復(fù)雜，防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻。由于塞內(nèi)卡病毒引起的臨床發(fā)病癥狀與口蹄疫相似，且能與其形成混合感染，對(duì)口蹄疫的防控形成嚴(yán)重干擾，因此急需一個(gè)技術(shù)平臺(tái)開展塞內(nèi)卡病毒基礎(chǔ)理論研究和防控產(chǎn)品創(chuàng)制。利用反向遺傳操作技術(shù)平臺(tái)建立SVA感染性克隆，研究塞內(nèi)卡病毒變異、致病機(jī)制及高效疫苗研制等工作，顯得尤為重要和迫切。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種針對(duì)正鏈RNA病毒的單質(zhì)粒高效拯救系統(tǒng)，包括用所述單質(zhì)粒拯救系統(tǒng)構(gòu)建SVA感染性克隆的方法，以及利用該拯救系統(tǒng)定向構(gòu)建、拯救SVA用于病毒基因功能、病毒變異及致病機(jī)制等基礎(chǔ)研究和定向設(shè)計(jì)制備反向重組疫苗的應(yīng)用研究。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種針對(duì)正鏈RNA病毒的單質(zhì)粒拯救系統(tǒng)，所述單質(zhì)粒拯救系統(tǒng)為包含有正鏈RNA病毒核酸序列的真核轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，所述真核轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒在病毒核酸序列的5'端上游含人巨細(xì)胞病毒RNA聚合酶II啟動(dòng)子、鼠源RNA聚合酶I啟動(dòng)子和核酶序列；在病毒核酸序列的3'端下游含核酶、鼠源聚合酶終止子I和聚合酶終止子II序列；

所述正鏈RNA病毒包括塞內(nèi)卡病毒。

優(yōu)選的，所述真核轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的骨架載體包括pcDNA3.1。

優(yōu)選的，當(dāng)所述正鏈RNA病毒為塞內(nèi)卡病毒時(shí)，將所述塞內(nèi)卡病毒的核苷酸序列插入pcDNA3.1的PacI和NotI酶切位點(diǎn)之間。

優(yōu)選的，所述插入的塞內(nèi)卡病毒的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本發(fā)明提供了一種塞內(nèi)卡病毒全長(zhǎng)感染性克隆的構(gòu)建方法，包括以下步驟：(1)以SVV/FJ/001株的cDNA為模板，用特異性引物對(duì)擴(kuò)增SVV/FJ/001株的A基因；所述特異性引物對(duì)包括上游引物和下游引物SVA-AR；所述上游引物包括SVA-1F0和SVA-1F，所述上游引物SVA-1F0的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述上游引物SVA-1F的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述下游引物SVA-AR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；