[發明專利]一種海洋浮游動物通用宏條形碼擴增引物有效
| 申請號： | 202010112359.3 | 申請日： | 2020-02-24 |
| 公開（公告）號： | CN111304336B | 公開（公告）日： | 2023-06-30 |
| 發明（設計）人： | 李宏俊;孫藝;王孝程;李冬梅;王睿睿;葉金清;李飛;劉玉安;明紅霞;蘇潔 | 申請（專利權）人： | 國家海洋環境監測中心 |
| 主分類號： | C12Q1/6888 | 分類號： | C12Q1/6888;C12Q1/6806;C12N15/11;C40B50/06 |
| 代理公司： | 北京國翰知識產權代理事務所(普通合伙) 11696 | 代理人： | 吳勝平 |
| 地址： | 116000 遼*** | 國省代碼： | 遼寧;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 海洋 浮游動物 通用 條形碼 擴增 引物 | ||
1.一組用于標記海洋浮游動物待測序核酸樣品的條形碼序列用于測序文庫的構建和/或用于測序的用途，其特征在于：將Barcode包含在用于擴增海洋浮游動物DNA條形碼序列的PCR引物中，從而構成相對應的Barcode-PCR引物，通過PCR方法將Barcode引入待測序序列中；在所述的Barcode-PCR引物中，所述的Barcode不通過連接子與用于擴增待測序序列的PCR引物的5’端或3’端相連；所述的Barcode-PCR引物用作PCR的3’端引物或5’端引物，或同時用作3’端引物和5’端引物；
所述Barcode包括：
Barcode1：AGTCTAGC；Barcode2：ACTGCAGC；Barcode3：CTATGCGT；Barcode5：TCAGATCA；Barcode6：TCCAGTGC；Barcode7：GTCATCGA；Barcode9：TCGATCCG；和Barcode10：AATCGTAG；
PCR引物對為引物F1和引物R7、引物F2和引物R9、引物F5和引物R6、引物F3和引物R10；
所述引物F1：其序列中包含Barcode1，其序列為SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列；引物R7：其序列中包含Barcode7，其序列為SEQ?ID?NO:17所示的核苷酸序列；
引物F2：其序列中包含Barcode2，其序列為SEQ?ID?NO:2所示的核苷酸序列；引物R9：其序列中包含Barcode9，其序列為SEQ?ID?NO:19所示的核苷酸序列；
引物F5：其序列中包含Barcode5，其序列為SEQ?ID?NO:5所示的核苷酸序列；引物R6：其序列中包含Barcode6，其序列為SEQ?ID?NO:16所示的核苷酸序列；
引物F3：其序列中包含Barcode3，其序列為SEQ?ID?NO:3所示的核苷酸序列；引物R10：其序列中包含Barcode10，其序列為SEQ?ID?NO:20所示的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的用途，其特征在于：通過PCR反應用于擴增樣品中的18S?rDNAV4區；獲得的擴增產物的上游和下游各含有一個Barcode，這兩個Barcodes作為該樣品的特異性標記，用于和其他待測序樣品進行區分。
3.一組用于構建海洋浮游動物18S?rDNA多重測序文庫的方法，包括以下步驟：
a、樣品的采集及預處理；
b、樣品基因組DNA的提??；
c、18S?rDNA?V4區的PCR擴增及產物純化；
d、純化的PCR產物進行樣品間的等量混合；
所述步驟c中PCR擴增采用權利要求1中所述的PCR引物對。
4.根據權利要求3所述的一組用于構建海洋浮游動物18S?rDNA多重測序文庫的方法，其特征在于：所述的樣品基因組DNA的提取用CTAB裂解液包括：2％CTAB；100mM?Tris-HClpH8.0；1.4mM?NaCl；10mM?EDTA；1mM川芎嗪。
5.根據權利要求3所述的一組用于構建海洋浮游動物18S?rDNA多重測序文庫的方法，其特征在于：所述的樣品基因組DNA的提取為：用2μm微孔濾膜過濾樣品培養液，收集微型浮游生物，提取樣本中的基因組DNA，取含有微型浮游生物的濾膜于1.5ml離心管中，加入600μL?CTAB裂解液和12μLβ-巰基乙醇，65℃裂解1h；取出濾膜，用酚氯仿抽提2次后，加入兩倍體積無水乙醇沉淀DNA，70％乙醇清洗沉淀，加入RNaseA?37℃處理30min后，得到微型浮游生物基因組DNA。
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