本發(fā)明涉及使用具有突變的Kup轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)菌株發(fā)酵生產(chǎn)L?賴氨酸的方法。

L-賴氨酸是通過物種谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)菌株的發(fā)酵產(chǎn)生的。改善生產(chǎn)方法的工作正在不斷進(jìn)行。改善可能涉及發(fā)酵技術(shù)，涉及將發(fā)酵液加工成合適的產(chǎn)品形式，或者可能涉及微生物本身的固有性能特性。

物種谷氨酸棒桿菌的各種細(xì)菌菌株的染色體的核苷酸序列可在公共可訪問的數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得，并可用于菌株開發(fā)目的。一個(gè)這樣的數(shù)據(jù)庫(kù)是NCBI(National Center forBiotechnology Information，U.S.National Library of Medicine 8600RockvillePike，Bethesda MD，20894USA)的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。

在針對(duì)生物體測(cè)序的染色體注釋過程期間，通過向數(shù)據(jù)庫(kù)提供信息的提供者，向鑒定的結(jié)構(gòu)例如基因或編碼序列提供稱為locus_tag的唯一標(biāo)識(shí)符。

谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032染色體的核苷酸序列及其分析由例如Nakagawa等人在EP1108790A2中描述。該信息可在NCBI以登錄號(hào)NC_003450獲得。在以登錄號(hào)NC_003450公開的染色體序列中，locus_tag NCgl0682標(biāo)識(shí)了注釋為編碼K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核苷酸序列。多肽的氨基酸序列可在標(biāo)識(shí)符NP_599944下獲得。

Kalinowski等人獨(dú)立地描述了谷氨酸棒桿菌ATCC13032染色體的核苷酸序列及其分析(Journal of Biotechnology 104(1-3)，5-25(2003))。該信息可在NCBI以登錄號(hào)NC_006958獲得。Locus_tag CGTRNA_RS03565標(biāo)識(shí)了注釋為編碼鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Kup的核苷酸序列。old_locus_tag指定cg0817也在本領(lǐng)域中使用。多肽的氨基酸序列可在標(biāo)識(shí)符WP_011013837下獲得。locus_tag NCgl0682和CGTRNA_RS03565的核苷酸序列是相同的。Kup轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2。kup基因的相應(yīng)核苷酸序列是由NCgl0682標(biāo)識(shí)并示于SEQ ID NO：1下的基因。

WO 01/00805還公開了根據(jù)SEQ ID NO：2的谷氨酸棒桿菌的kup基因，以及編碼涉及膜合成和膜轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白的谷氨酸棒桿菌的其他基因，并且通常教導(dǎo)在這些基因中修飾谷氨酸棒桿菌菌株增加例如L-賴氨酸的生產(chǎn)。

Follmann等人(Journal of Bacteriology 191(9),2944-2952,2009)研究了谷氨酸棒桿菌中的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)。他們提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)，表明潛在的鉀通道CglK是谷氨酸棒狀桿菌中唯一的功能性鉀攝取系統(tǒng)。所述鉀通道CglK被由old locus_tag指定cg0887標(biāo)識(shí)的核苷酸序列編碼。Follmann等人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，缺少由old locus_tag cg0817標(biāo)識(shí)的kup基因的細(xì)胞在生長(zhǎng)中沒有顯示出差異。

本發(fā)明的目標(biāo)是提供通過物種谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)的細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的新措施。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與未修飾的L-賴氨酸生產(chǎn)細(xì)菌相比，通過將SEQ ID NO：2所示多肽的編碼的氨基酸序列的位置344處的氨基酸甘氨酸交換為不同的蛋白原氨基酸(即L-纈氨酸)來修飾物種谷氨酸棒桿菌的L-賴氨酸分泌細(xì)菌，在發(fā)酵過程中增加了其分泌L-賴氨酸的能力。

本發(fā)明提供了發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的新方法，該方法包括以下步驟：提供具有分泌L-賴氨酸能力的物種谷氨酸棒狀桿菌的細(xì)菌，該細(xì)菌在其染色體中含有編碼包含SEQ IDNO：2的氨基酸的多肽的多核苷酸，其中位置344處的氨基酸甘氨酸被纈氨酸取代，在合適的條件下在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌，并在該培養(yǎng)基中積累L-賴氨酸以形成含L-賴氨酸的發(fā)酵液。在這種發(fā)酵過程中，與包含培養(yǎng)沒有這種取代的物種谷氨酸棒桿菌的L-賴氨酸分泌細(xì)菌的方法相比，L-賴氨酸的生產(chǎn)增加。