本發(fā)明基于ASFV的P72基因、MGF基因和CD2V基因序列，設(shè)計合成了針對該三個基因的特異性引物與探針，建立了ASFV強(qiáng)弱毒的鑒別診斷方法并進(jìn)行了臨床和實驗樣品的檢測，因而本發(fā)明提供含有所述引物和探針的非洲豬瘟病毒強(qiáng)弱毒熒光定量PCR鑒別診斷試劑盒。采用該試劑盒適應(yīng)于ASFV強(qiáng)弱毒的鑒別診斷。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及獸醫(yī)領(lǐng)域，具體為動物疾病診斷和病原檢測，更具體涉及非洲豬瘟及其病原病毒的檢測和診斷，尤其是非洲豬瘟強(qiáng)弱毒的鑒別。

背景技術(shù)

非洲豬瘟(African?Swine?Fever，ASF)是由雙股線性DNA的非洲豬瘟病毒(African?Swine?Fever?Virus，ASFV)感染豬引致的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病(J.M.ARIAS?M..African?swine?fever.In:Diseases?of?Swine,tenthEdition,Straw?B.,D’Allaire?S.,Mengeling?W.,TaylorD.,eds.Iowa?StateUniversity,USA,2012,pp:396–404；D.Zhao,R.Liu，X.Zhang,et?al.Replication?andvirulence?in?pigs?of?the?first?African?swine?fever?virus?isolated?in?China[J].Emerging?MicrobesInfections，2019,8:438-447)。病程短、病死率家豬可達(dá)100％，其臨床癥狀和病理變化與急性豬瘟相類似，表現(xiàn)為高熱、皮膚充血、流產(chǎn)、水腫及臟器出血。該病為世界動物衛(wèi)生組織[World?Organization?for?Animal?Health(英)，OfficeIntentional?des?Epizootic(法)，OIE]必須報告的動物疫病和我國動物疫病名錄的一類動物疫病。病毒在鮮肉和腌肉中能存活數(shù)月，但高溫、消毒劑都能對它進(jìn)行有效殺滅。

家豬和野豬是ASFV的易感動物，且不同品種、性別和年齡豬均易感。軟蜱是該病毒的自然宿主和傳播媒介。傳播途徑多以口、鼻直接接觸為主，建立ASFV強(qiáng)弱毒的鑒別診斷方法并組裝成試劑盒在臨床上推廣應(yīng)用，顯得十分必要和具有現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對上述目的，研發(fā)了非洲豬瘟病毒強(qiáng)弱毒熒光定量PCR鑒別方法所用的診斷試劑盒。其適用于樣品中的非洲豬瘟強(qiáng)毒(野毒)核酸的檢測，以及非洲豬瘟強(qiáng)毒與MGF基因缺失株，和CD2V與MGF基因聯(lián)合缺失株的鑒別診斷。

本發(fā)明提供一種非洲豬瘟病毒MGF基因缺失弱毒熒光定量PCR鑒別診斷試劑盒，其包括下述檢測用引物對：

正向引物MGF-F：5`cctagctctcgacagaggtccc3`，

反向引物MGF-R：5`aaggctcataaaatcagcaggtatt3`，

探針MGF-probe：5`ctccgtgttgacagataccagcccg3`。

更具體的，所述MGF基因缺失是指非洲豬瘟病毒的MGF360-505R基因缺失病毒，所述非洲豬瘟病毒是基因I?I型的非洲豬瘟病毒，更具體是全長基因組序列如GenBank：MK333180.1中所述的中國流行株P(guān)ig/CN/HLJ/2018。

更具體的，所述MGF360-505R基因缺失病毒相對于原始毒株全長序列缺失了第27942-35500位核苷酸。一個具體實施方式中，所述MGF360-505R基因缺失病毒，保藏號為CCTCC?NO:V201925。

另一方面，本發(fā)明還提供一種非洲豬瘟病毒CD2V與MGF基因聯(lián)合缺失株弱毒熒光定量PCR鑒別診斷試劑盒，其包括下述檢測用引物對：

正向引物MGF-F：5`cctagctctcgacagaggtccc3`，