[發明專利]嗜幾丁質類芽孢桿菌幾丁質酶基因及其克隆表達與應用有效
| 申請號： | 201910945593.1 | 申請日： | 2019-09-30 |
| 公開（公告）號： | CN111235133B | 公開（公告）日： | 2023-09-22 |
| 發明（設計）人： | 姜明國;楊立芳;劉聰;申乃坤;吳家法;黃文善;朱英芝;許劍;王金子 | 申請（專利權）人： | 廣西民族大學;廣西綠友農生物科技股份有限公司 |
| 主分類號： | C12N9/42 | 分類號： | C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;C12P19/26;C12P19/14 |
| 代理公司： | 北京元本知識產權代理事務所(普通合伙) 11308 | 代理人： | 曹廣生 |
| 地址： | 530006 廣西壯族*** | 國省代碼： | 廣西;45 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 幾丁質 芽孢 桿菌 基因 及其 克隆 表達 應用 | ||
1.一種嗜幾丁質類芽孢桿菌幾丁質酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
2.根據權利要求1所述的一種嗜幾丁質類芽孢桿菌幾丁質酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
S1:提取菌株GDMCC?NO:60710的DNA，根據已構建的嗜幾丁質類芽孢桿菌轉錄組注釋的幾丁質酶基因部分序列，設計引物擴增幾丁質酶功能基因，所述引物序列為：
Forwardprimer:5’-CGGGATCCCGAACCGGCCAAAATCGTCGG-3’，
Reverseprimer:5’-CCGCTCGAGGCTGCCTGTTACCACAATATTCG-3’；
應用PCR擴增技術獲得所述幾丁質酶基因全長序列,測序驗證目的序列是否正確；
S2:對所述幾丁質酶基因進行克隆與轉化；
對幾丁質酶基因和質粒pET-22b(+)分別進行雙酶切和純化后，將得到的目的片段和pET-22b(+)載體進行連接，得到重組子pET-22b(+)-CHI；
將重組子pET-22b(+)-CHI轉化到E.coliTOP10感受態細胞中構建基因組文庫；菌落電泳進行陽性重組子的驗證，進一步測序驗證目的序列的正確性；
S3:所述幾丁質酶的表達與純化；
將上述重組子pET-22b(+)-CHI轉化到E.coli?RosettagamiB(DE3)感受態細胞中，IPTG誘導幾丁質酶蛋白的表達，通過SDS-PAGE分析目的蛋白的表達情況；確定工程菌經誘導產幾丁質酶后，收集菌體，超聲破壁收集粗酶液，對重組酶進行分離純化。
3.一種編碼權利要求1所述嗜幾丁質類芽孢桿菌幾丁質酶的基因，其特征在于，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。
4.根據權利要求3所述的編碼基因在降解幾丁質方面的應用。
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