本發明公開了一種高靈敏、快速定量檢測T4多核苷酸激酶的方法，步驟是：（1）以Fe³⁺為配位中心，BDC為有機配體，合成金屬有機骨架Fe?MIL?88；（2）將熒光素標記的DNA單鏈FAM?ssDNA與其互補鏈退火形成雙鏈FAM?dsDNA；（3）FAM?dsDNA經培育后，被T4 PNK催化磷酸化，磷酸化的FAM?dsDNA被λ exo裂解得到FAM?ssDNA；（4）加入Fe?MIL?88，裂解得到FAM?ssDNA熒光被猝滅，通過檢測FAM的熒光強度來定量檢測T4 PNK酶活性。靈敏簡便，選擇性好。

技術領域

本發明屬納米材料、熒光傳感技術和生物分析檢測領域，具體涉及基于偶聯核酸外切酶反應和金屬有機骨架（MOFs）—Fe-MIL-88的熒光傳感納米平臺用于定量測定細胞裂解液中T4多核苷酸激酶（T4 PNK）的方法。

背景技術

T4多核苷酸激酶（T4 PNK）是由T4噬菌體所感染的大腸桿菌分離出來的酶。多核苷酸激酶（PNK）能夠催化三磷酸腺苷（ATP）的γ-磷酸基團轉移到DNA或RNA的5′-OH末端并生成ADP的反應。在大多數正常的細胞活動包括DNA重組、復制、修復過程中，該磷酸化反應是一個必不可少的過程。一般來說，各種外源性和內源性因素包括電離輻射、化學物質和核酸酶等都可能導致核酸中5'端羥基化，從而損傷DNA，使基因組不穩定。多核苷酸激酶通過轉移ATP的γ-磷酸基團至DNA末端從而負責修復核酸的5′端羥基自由基。PNK功能障礙可能導致許多細胞活動發生異常，如核酸代謝、DNA復制、DNA重組、DNA鏈損傷修復異常等，最終誘發多種人類疾病，包括沃納綜合征、Rothmund-Thomson綜合征等。此外，由于PNK抑制劑能夠提高人體腫瘤對γ-射線的敏感性，PNK可能為癌癥放射治療的一個有重大潛力的靶點。因此，建立一種高靈敏性，選擇性好，便于操作的PNK活性檢測及其抑制劑篩選的方法對基礎生化研究、臨床診斷和藥物發現具有重要意義。

目前，用于檢測PNK活性的常規分析方法主要包括聚丙烯酰胺凝膠電泳、放射自顯影、自由基同位素³²p標記技術等，但這些方法存在復雜、耗時、潛在的放射性危害等缺陷。近年來，納米通道生物傳感器、電化學方法、比色法、熒光法等逐漸引起關注，其中熒光法以其簡便、高效、靈敏等優點越來越受到人們的重視。

近年來，金屬有機骨架材料（MOFs）作為一種具有晶體多孔性的新型材料，以其生物降解性、高比表面積和靈活可控的孔隙度，顯示出了巨大的應用潛力。MOFs的常見應用包括氣體儲存、催化和藥物傳遞。此外，利用MOFs具有良好的猝滅能力，可以用于構建熒光傳感平臺。MOFs通常對單鏈DNA（ssDNA）顯示良好的吸附作用。這是由于MOFs包含的有機基團通常存在π電子共軛體系產生π-π相互作用的結果，同時為可能的氫鍵提供來源。然而，利用MOFs進行酶活性檢測的例子很少，因此利用MOFs進行酶活性檢測的應用尚待進一步探索。

發明內容

針對現有技術存在的設計復雜、操作繁瑣、費用高等缺陷，本發明的目的在于提供一種基于偶聯核酸外切酶反應和MOFs（Fe-MIL-88）的用于高靈敏、快速定量檢測T4多核苷酸激酶的方法。利用λ exo對磷酸化DNA的裂解作用、Fe-MIL-88對ssDNA和雙鏈DNA（dsDNA）的吸附能力的明顯區別及其良好的熒光猝滅能力，檢測細胞裂解液中T4 PNK酶活性。

為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：

一種快速定量檢測T4 PNK酶的方法，步驟如下：