本發明公開了四環素及其降解產物對大腸桿菌生態毒性的評估方法,包括如下步驟:(1)菌種生長曲線測定；(2)菌種活化擴增培養；(3)四環素(TTC)標準溶液對大腸桿菌的生長抑制；(4)計算四環素標準溶液對大腸桿菌的生長抑制率；(5)四環素及降解產物對大腸桿菌的生長抑制；(6)計算四環素及降解產物對大腸桿菌的生長抑制率；(7)根據四環素標準溶液對大腸桿菌的抑制率；(8)通過對比相同去除率的四環素及其產物與四環素標準溶液的生長抑制率，評估四環素降解過程中的生態毒性變化。實驗過程簡單易操作，能夠有效評估四環素類抗生素遷移轉化過程中可能產生的生態毒性。

技術領域

本發明屬于環境生態學領域，具體涉及一種農用抗生素四環素及其降解產物對大腸桿菌的生態毒性的研究方法，能夠用于研究環境中四環素遷移轉化過程中對微生物生態毒性的變化。

背景技術

廣譜和高效的四環素類抗生素是人醫和獸醫臨床上重要的抗感染藥物，但由于其廣泛應用，尤其是不規范使用導致其耐藥水平不斷升高，導致臨床感染性疾病治療失敗的風險加大，從而對人和動物的健康構成嚴重威脅。該類藥物使用后，大部分以原形或者代謝物的形式進入到環境，使土壤環境或水體中能夠檢測到一定程度的殘留。殘留藥物易對環境生態系統產生破壞，對微生物群落具有一定的毒性效應，甚至可以通過食物鏈富集，對人體健康產生危害。四環素類抗生素產生的危害已經不容忽視，因此，尋找一種高效方法去除環境中殘留的四環素類抗生素非常必要。

大腸桿菌(Escherichia coli)是人和許多動物腸道中最主要且數量最多的一種細菌，可隨動物糞便排入環境中，因而在土壤環境中廣泛分布。大腸桿菌是與我們日常生活關系非常密切的一類細菌，且在土壤微生物群落和生態環境中起到重要作用，因其結構簡單，繁殖迅速，培養容易，大腸桿菌常作為生物學研究上的重要實驗材料。因此，本發明中使用Escherichia coli CICC23675作為土壤微生物群落的代表。

目前的研究中大多關注四環素類抗生素在環境中的遷移轉化，尋求高效的去除方法，而忽視了該類抗生素降解過程中對微生物群落產生的生態毒性的變化。因此，本發明選取一種典型的四環素類抗生素，研究其在降解過程中對大腸桿菌生長的抑制作用，從而對四環素及其降解產物對土壤典型微生物群落的生態毒性進行評估。

發明內容

本發明的目的在于提供一種評估四環素在其降解過程中對微生物(Escherichiacoli CICC23675)生態毒性變化的方法，通過對四環素及其產物生態毒性的研究，評估該抗生素轉化過程中對生態環境的影響，從而尋找“解毒效果最好”的去除方法，替代傳統研究中“污染物去除率最大”的去除方法。

為實現上述目的，本發明采用了以下技術方案：

(1)菌種生長曲線測定：使用菌種為Escherichia coli CICC23675菌液，首先取25μL菌液接種于100mL MH(B)液體培養基中，在37℃，120r/min搖床中培養，按一定時間間隔(2h)取樣，用紫外分光光度計測定600nm處吸光度(OD600)，600nm吸光度與大腸桿菌密度正相關。繪制“OD600-培養時間”曲線，得到進入生長對數期所需的培養時間。

(2)菌種活化擴增培養：首先取25μL菌液接種于100mL MH(B)液體培養基中，在37℃，120r/min搖床中培養10h，獲得培養對數期的菌液用于毒性分析實驗。

(3)四環素(TTC)標準溶液對大腸桿菌的生長抑制：本發明中采用對大腸桿菌的生長抑制率表示對微生物的毒性效應，配制不同濃度的四環素標準溶液(0-200μM)，按照1mL標準溶液+5mL MH(B)培養基+10μL步驟(2)中的菌液(稀釋至OD₆₀₀＝0.20)形成實驗體系。上述溶液在試管里混勻后，放置于搖床，37℃，170r/min培養8h后，測定OD₆₀₀。空白對照樣品用去離子水替代樣品。所有操作在超凈工作臺中進行，保證無菌環境。每次實驗設陰性對照樣品，即溶液中不加菌液，以證明實驗中沒有雜菌污染。2組平行。