本發明屬于酶的基因工程技術領域，具體涉及一種磷脂酶D突變體及其制備與應用。其技術方案是利用重組DNA技術對野生型磷脂酶D基因進行定點突變，得到活力較高的磷脂酶D基因，然后將高活力磷脂酶D基因在枯草芽孢桿菌表達系統、畢赤酵母表達系統(包括畢赤酵母游離表達系統和畢赤酵母細胞表面展示系統)中表達，得到產高活力磷脂酶D的重組菌株，表達后，檢測高活力磷脂酶D的比酶活較野生型磷脂酶D提高38?140％，高活力磷脂酶D在枯草芽孢桿菌表達系統、畢赤酵母表達系統、畢赤酵母表面展示系統內發酵酶活最高值分別為36.8U/ml、48.1U/ml、140.2U/(g·細胞干重)。

本申請為發明專利申請201610402557.7的分案申請，201610402557.7的申請日為2016年6月2日，申請號為201610402557.7，發明名稱為一種新型磷脂酶D及其制備磷脂酸、磷脂酰絲氨酸的方法。

技術領域：

本發明屬于酶的基因工程技術領域，具體涉及通過重疊PCR技術體外定向進化獲得比酶活提高的磷脂酶D突變體，并提供由高活力磷脂酶D催化制備磷脂酸和磷脂酰絲氨酸的方法。

背景技術：

磷脂酶D(PLD)分布廣泛，存在于各種動植物和微生物中。PLD對磷脂分子中的磷酰氧鍵P-O起作用，其生物催化作用主要體現在兩種反應：(1)水解磷脂上的末端磷酸酯鍵生成磷脂酸和羥基化合物；(2)當有另一種含羥基的化合物存在時，可催化磷脂酰基與其結合，形成新的磷脂，即磷脂酰基轉移反應。

磷脂酸(Phosphatidic acid,PA)是一種簡單而又常見的磷脂，廣泛存在于動植物細胞中，是動植物細胞生物膜的基本成分。PA由甘油骨架、1或2號位的脂肪酸基團、3號位的磷酸基組成。PA是PLD作用的直接產物，PA能夠帶動Ca²⁺激活或協同激活細胞內各種酶，與此同時，PA還可促進細胞有絲分裂、促進細胞內超氧化物的形成、引起肌肉的收縮、促進激素分泌、誘發血小板聚集等作用。基于以上作用，PA可應用在食品工業、醫藥工業、化妝品等方面。

磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)是一類普遍存在的磷脂，通常位于細胞膜內層，是細胞膜的重要組成部分，由于參與一系列膜功能反應，尤其在人體的神經系統中，是大腦細胞膜的重要組分之一，其對改善記憶力、緩解壓力、修復大腦損傷、治療兒童多動癥、抑郁癥以及預防老年癡呆癥等作用效果顯著。但具有一定純度磷脂酰絲氨酸自然界中含量稀少，故制備純度高、質量好的磷脂酰絲氨酸產品具有重要意義。

酶法制備磷脂酸或磷脂酰絲氨酸是指在一定條件下，用PLD催化底物(如PC)反應生成磷脂酸或磷脂酰絲氨酸，該方法相比化學合成具有反應條件溫和、副產物少、產品得率高、質量好等優點。生產磷脂酸或磷脂酰絲氨酸的不同點在于PLD催化反應類型不同，前者屬于水解反應，后者則是通過使用PLD的磷脂酰基移轉(transphosphatidylation)反應，對磷脂的頭基進行修飾。

酶分子體外定向進化屬于蛋白質的非理性設計，屬于蛋白質工程的范疇。通常手段是利用分子生物學手段在分子水平創造出分子的多樣性，結合靈敏、高通量的篩選技術，從而能夠在短時間內得到理想的突變體。它不需事先了解蛋白質的空間結構、活性位點、催化機制等因素，而是人為地創造特殊的進化條件，模擬自然進化機制，在體外改造酶基因，獲得具有某些預期特征的改構酶，與此不同，需要事先了解蛋白質的空間結構、活性位點、催化機制等因素，并根據這些因素有的放矢做對其DNA進行改造的是定點突變。

定點突變，又稱為理性設計，就是在已知的DNA序列中插入、缺失或取代一定長度的核苷酸序列，由于其迅速、高效的提高DNA所表達的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段。本發明所使用的重疊PCR技術是定點突變技術的一種，該技術可以簡單、快速的將兩個或多個基因片段通過末端互補、重疊延伸進行體外基因的拼接。重疊PCR技術可以獲得依靠限制性內切酶消化難以得到的產物，并且方便快速，在進行大片段基因的定點突變、基因片段刪除以及多個編碼序列嵌合連接上具有獨有的優勢。