1.基于磁性熒光探針的食品大腸桿菌菌落可視化檢測(cè)及自動(dòng)化計(jì)數(shù)方法，其特征在于，步驟如下：

步驟1、磁性納米微球的制備，記為Fe₃O₄@SiO₂-cDNA；

六水氯化鐵、三水合乙酸鈉和檸檬酸三鈉分別加入乙二醇中，40~60℃下磁力攪拌8~12h，將混合液轉(zhuǎn)入到反應(yīng)釜中，在180~200℃條件靜置8~16 h，得到反應(yīng)的混合液，經(jīng)去離子水和乙醇各洗滌3次，磁性分離得到的產(chǎn)物在50~70℃下真空干燥6~12 h，即可得到Fe₃O₄納米顆粒；所述六水氯化鐵、三水合乙酸鈉、檸檬酸三鈉和乙二醇的用量比為10~100 g： 20~200 g：2~20 g：1 L；

稱取Fe₃O₄納米顆粒溶解于乙醇A和水的混合溶液中，超聲震蕩15 min~60 min形成均勻溶液，然后將氨水加入到混合液中，超聲震蕩30 min~120 min，最后將正硅酸乙酯加入到混合液中，超聲震蕩45 min~120 min，將得到的混合液經(jīng)去離子水和乙醇B各洗滌3次，磁性分離的產(chǎn)物在50~70℃真空干燥箱中干燥6~12 h，即可得到Fe₃O₄@SiO₂；所述Fe₃O₄、氨水、正硅酸乙酯、乙醇A和水的用量比為4~20 g：0.05~0.2 L：0.01~0.1 L：1~5 L：1~2 L；

將Fe₃O₄@SiO₂加入到甲苯和氨丙基三甲氧基硅烷中，在100 ~ 150℃條件下攪拌20~30h，將得到的混合液經(jīng)去離子水和乙醇各洗滌3次，磁性分離的產(chǎn)物在50 ~70℃真空干燥箱中干燥5~12 h，即可得到Fe₃O₄@SiO₂-NH₂；所述Fe₃O₄@SiO₂、甲苯和氨丙基三甲氧基硅烷加入的用量比為10~50 g：5~15 L: 1~2 L；

將羧基修飾的適配體互補(bǔ)鏈加入到EDC和NHS的混合液中，記為EDC/NHS溶液，充分震蕩15~45 min；隨后將得到的Fe₃O₄@SiO₂-NH₂加入EDC/NHS溶液中震蕩2~8 h；得到的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)磁性分離并經(jīng)過(guò)多次洗滌，即可得到磁性納米微球Fe₃O₄@SiO₂-cDNA；

在Fe₃O₄@SiO₂-cDNA中，F(xiàn)e₃O₄粒徑范圍為50~200 nm，SiO₂厚度為10~50 nm；所述EDC和NHS溶液的濃度均為20 mg/mL，且用量比為3：1；所述羧基修飾的適配體互補(bǔ)鏈的濃度范圍為15~35 μmol/L；所述Fe₃O₄@SiO₂-NH₂和EDC/NHS溶液的用量比為0.5~0.2 mg：1 mL；羧基修飾的適配體互補(bǔ)鏈，即cDNA的序列為COOH-TTAGCAAAGT AGCGTGCACT TTTG；

步驟2、熒光碳量子點(diǎn)的制備，記為aptamer-CQDs；

將檸檬酸、濃硫酸和乙二醇混合攪拌后，置于微波爐中加熱1~5 min，獲得碳量子點(diǎn)溶液；碳量子點(diǎn)溶液經(jīng)離心、透析去除碳量子點(diǎn)溶液中的雜質(zhì)，得到表面富含羧基的熒光碳量子點(diǎn)；將EDC/NHS混合液加入到熒光碳量子點(diǎn)溶液中攪拌10~20 min，隨后加入氨基修飾的大腸桿菌適配體并攪拌2~5 h，得到特異性熒光碳量子點(diǎn)，即為aptamer-CQDs；

所述檸檬酸、濃硫酸、乙二醇的用量比為0.4~0.1 g：0.5~0.05 mL：1 mL；

所述離心的條件為8000~15000 rpm，10~20 min；所述透析過(guò)程中透析袋截留分子量為1000 KD；

所述EDC和NHC溶液的濃度均為20 mg/L，EDC和NHC溶液的體積為(1~3): 1；所述碳量子點(diǎn)溶液和EDC/NHC溶液的體積比為1~5：1~2；

所述大腸桿菌適配體的終濃度為15~35 μmol/L，大腸桿菌適配體的序列為GCAATGGTACGGTACTT CCCCATGAGT GTT GTGAAAT GTT GGGACACTAG GTGGCATAGAGCCGCA AAAGTGCACG CTACTTTGC TAA-NH₂；

步驟3、磁性熒光探針Fe₃O₄@SiO₂-CQDs的制備，將步驟1中得到的Fe₃O₄@SiO₂-cDNA和步驟2中得到的aptamer-CQDs常溫下混合孵育，磁性分離除去多余的Fe₃O₄@SiO₂-cDNA，獲得磁性熒光探針Fe₃O₄@SiO₂-CQDs；

步驟4、食品中菌株菌落的培養(yǎng)；對(duì)食品樣品稀釋后，制備十倍遞增系列稀釋樣品勻液，稀釋梯度分別為10^-(p+1)，10^-(p+2)，10^-(p+3)，……，10^-(p+i)，其中p為大于或等于零的整數(shù)，i為大于零的整數(shù)；然后對(duì)不同梯度的樣品稀釋勻液進(jìn)行涂布平板培養(yǎng)，每個(gè)梯度接種n個(gè)固體培養(yǎng)基平板，n為大于零的整數(shù)；每個(gè)平板加入菌液進(jìn)行涂布，然后將平板倒置于一定環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后得到了不同稀釋梯度的食品菌株菌落平板；

步驟5、大腸桿菌菌落的快速識(shí)別； 將步驟3中制備的磁性熒光探針Fe₃O₄@SiO₂-CQDs加入到步驟4中的不同稀釋梯度的食品菌株菌落平板中，靜置一段時(shí)間；若菌落為大腸桿菌時(shí)，則大腸桿菌會(huì)與aptamer-CQDs結(jié)合，導(dǎo)致Fe₃O₄@SiO₂-cDNA和aptamer-CQDs分離；若菌落不是大腸桿菌，F(xiàn)e₃O₄@SiO₂-cDNA和aptamer-CQDs不會(huì)分離，以Fe₃O₄@SiO₂-CQDs的形式存在；

用磁鐵吸附將菌落平板中的Fe₃O₄@SiO₂-cDNA和Fe₃O₄@SiO₂-CQDs與菌落分離，然后將生長(zhǎng)有菌落的平板皿底放入便攜式熒光成像儀中，獲取稀釋梯度為10^-(p+1)的n個(gè)菌落平板的熒光平板圖像，記為P_1-1、P_1-2、P_1-3、……、P_1-n ，n為大于零的整數(shù)；同理獲取n個(gè)稀釋梯度為10^-(p+2)的熒光平板圖像P_2-1、P_2-2、P_2-3、……、P_2-n，獲取菌液稀釋梯度為10^-(p+3)的熒光平板圖像P_3-1、P_3-2、P_3-3、……、P_3-n，……，獲取稀釋梯度為10^-(p+i)的熒光平板圖像P_i-1、P_i-2、P_i-3、……、P_i-n，總共得到了i×n個(gè)菌落熒光平板圖像，i和n為大于零的整數(shù)；

如果菌落中有大腸桿菌，aptamer-CQDs會(huì)吸附在大腸桿菌菌落上，則大腸桿菌的菌落顯示熒光；如果菌落中沒(méi)有大腸桿菌aptamer-CQDs不會(huì)吸附在非大腸桿菌菌落上，同時(shí)非大腸桿菌菌落不顯示熒光；由此，實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌菌落的快速和可視化識(shí)別；

步驟6、食品中大腸桿菌菌落的自動(dòng)計(jì)數(shù)；

（1）對(duì)步驟5獲取的i×n個(gè)菌落熒光平板圖像進(jìn)行預(yù)處理，利用彩色圖像濾波函數(shù)imfilter對(duì)菌落熒光平板圖像進(jìn)行線性濾波，去除圖像中的噪聲；

（2）閾值分割：提取預(yù)處理圖像的藍(lán)（B）通道分量圖像，并將分量圖像灰度化，獲得B分量圖像的閾值T；利用閾值T對(duì)大腸桿菌菌落進(jìn)行分割，將高于閾值T的像素點(diǎn)定為1，低于閾值T的像素點(diǎn)定為0，得到了熒光平板菌落分割圖像；

（3）熒光平板菌落計(jì)數(shù)：采用八鄰域邊緣跟蹤法檢測(cè)熒光平板菌落分割圖像的菌落邊緣，并利用連通區(qū)域計(jì)數(shù)法對(duì)大腸桿菌菌落計(jì)數(shù)；對(duì)得到的i×n個(gè)熒光平板菌落分割圖像菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算每個(gè)稀釋梯度的大腸桿菌平均菌落數(shù)，稀釋梯度為10^-(p+1)的大腸桿菌平均菌落數(shù)記為N₁，稀釋梯度為10^-(p+2)的大腸桿菌平均菌落數(shù)記為N₂，稀釋梯度為10^-(p+3)的大腸桿菌平均菌落數(shù)為N₃，……，稀釋梯度為10^-(p+i)的大腸桿菌平均菌落數(shù)為N_i，其中，p為大于或等于零的整數(shù)，i和n為大于零的整數(shù)，并根據(jù)計(jì)算公式自動(dòng)計(jì)算出食品中大腸桿菌菌落總數(shù)；

所述計(jì)算公式具體分為4種：

A、若只有一個(gè)稀釋梯度（10^-(p+k)）平板的大腸桿菌菌落數(shù)在20~200 CFU之間，則計(jì)數(shù)該稀釋梯度菌落平板上的大腸桿菌菌落數(shù)，樣品中菌落數(shù)的計(jì)算公式為C(CFU/mL)=N_k /(V×10^-(p+k)) ；其中，C為食品樣品中的大腸桿菌菌落數(shù)，N_k為大腸桿菌菌落數(shù)，10^-(p+k)為稀釋梯度值，k為小于i的整數(shù)，i為大于零的整數(shù)，V為涂布平板時(shí)加入的食品樣品菌液體積，單位為mL；

B、若所有稀釋梯度菌落平板的大腸桿菌菌落數(shù)都小于20 CFU，即N₁，N₂，N₃，……，N_i＜20CFU，則計(jì)數(shù)最低稀釋梯度菌落平板上的大腸桿菌菌落數(shù)，樣品中菌落數(shù)的計(jì)算公式為C(CFU/mL)=N₁ /(V×10^-(p+1)) ；其中，C為樣品中的大腸桿菌菌落數(shù)，N₁為最低稀釋梯度的大腸桿菌菌落數(shù)，10^-(p+1)為最低稀釋梯度值，V為涂布平板時(shí)加入的食品樣品菌液體積，單位為mL；

C、若某一稀釋梯度（10^-(p+k)）菌落平板的菌落數(shù)大于200 CFU，但是下一梯度平板上沒(méi)有大腸桿菌菌落，或者雖有大腸桿菌菌落但菌落數(shù)不在20~200 CFU范圍內(nèi)，應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋梯度培養(yǎng)皿上的大腸桿菌菌落，食品樣品中菌落數(shù)的計(jì)算公式為C(CFU/mL)=N_k /(V×10^-(p+k))；其中，C為食品樣品中的大腸桿菌菌落數(shù)，N_k為大腸桿菌菌落數(shù)，10^-(p+k)為稀釋梯度值，k為大于或等于零小于i的整數(shù)，V為涂布平板時(shí)加入的樣品菌液體積，單位為mL；

D、若有2個(gè)連續(xù)梯度（10^-(p+k)和10^-(p+k+1)）菌落平板的菌落數(shù)均在20~200 CFU之間，食品樣品中的菌落數(shù)的計(jì)算公式為C(CFU/mL)= (N_k+N_k+1) /(1.1V×10^-(p+k))；其中，C為食品樣品中的大腸桿菌菌落數(shù)，N_k為低稀釋梯度大腸桿菌菌落數(shù)，N_k+1為高稀釋梯度大腸桿菌菌落數(shù)，1.1為計(jì)算系數(shù)，10^-(p+k)為低稀釋梯度的稀釋梯度值，k為大于或等于零小于i的整數(shù)，V為涂布平板時(shí)加入的食品樣品菌液體積，單位為mL。