本發(fā)明公開了一種香蕉枯萎菌4號(hào)生理小種AGO基因缺失突變體及其小RNA。采用同源置換的原理，構(gòu)建了香蕉枯萎菌Δago1、Δago2和Δago1/2基因缺失突變體，并進(jìn)行了非生物脅迫測(cè)試和致病力分析，結(jié)果顯示經(jīng)過熒光增白劑CFW處理后，Δago2缺失突變體更加敏感，生長受到抑制，MgCl₂處理后，Δago1突變體、Δago2突變體和Δago1/2突變體的生長均受到抑制。Δago1突變體致病力增強(qiáng)，Δago2突變體和Δago1/2突變體致病力減弱；此外，結(jié)合小RNA深度測(cè)序獲得各突變體小RNA，為進(jìn)一步解析香蕉枯萎病的致病機(jī)制，開發(fā)RNA來源的防控措施等提供理論和技術(shù)支撐。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種香蕉枯萎菌4號(hào)生理小種AGO基因缺失突變體及其小RNA，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

小分子RNA是在真核生物中廣泛存在的一類21-24nt的非編碼RNA，包括miRNA(microRNA)和siRNA(small interfering RNA)，它可以與含Argouaute(AGO)蛋白的核酶復(fù)合物結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體RISC(RNA induced silencing complex)，通過剪切靶標(biāo)mRNA或翻譯抑制的方式導(dǎo)致序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默調(diào)控。AGO蛋白是RISC復(fù)合體中的重要組分，在小RNA介導(dǎo)的基因沉默中發(fā)揮重要作用。AGO蛋白全長700-1200個(gè)氨基酸殘基，包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是N末端、PAZ、MID和PIWI結(jié)構(gòu)域。Dice切割dsRNA產(chǎn)生5'端磷酸基、3'端羥基且含有2nt核苷酸突出的21-24nt小片段siRNAs后，與含有PAZ功能域的AGO蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，該復(fù)合體具有序列特異性的核酸內(nèi)切酶活性，能夠特異性的降解與siRNA同源的靶標(biāo)mRNA。

RNA沉默(RNAsilencing)或基因沉默(gene silencing)是廣泛存在于植物、動(dòng)物、線蟲和真菌等真核生物中的一種高度保守的、序列特異的RNA降解機(jī)制。RNA基因沉默是在秀麗小桿線蟲(Caenorhabditis elegans)發(fā)現(xiàn)的由雙鏈RNA(dsRNA)以序列特異性方式發(fā)生轉(zhuǎn)錄后沉默(post transcriptional silencing,PTGS)的現(xiàn)象(Fire et al.,1998)。Romano和Macino將粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)內(nèi)源基因al-1的同源片段導(dǎo)入后，發(fā)現(xiàn)albino-1基因的表達(dá)受到抑制，他們將這種現(xiàn)象稱為RNA靜息(quelling)(RomanoandMacino,1992)。隨后，研究者獲得了一系列quelling功能缺失突變菌株，對(duì)這些突變株的研究證明了quelling途徑與siRNAs相關(guān)(Cogoni and Macino,1997)。其中，QDE-1編碼細(xì)胞依賴RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)，而RdRP是其他真核生物RNAi所必需的重要組成元件(Cogoni and Macino,1999)。此外，QDE-2基因編碼一個(gè)含有piwi-PAZ結(jié)構(gòu)域的Argonaute蛋白，是秀麗小桿線蟲RDE-1(RNAi-deficient-1)的同源蛋白，是真核生物RNA沉默途徑中重要的保守元件之一。QDE-3編碼的蛋白屬于RecQ家族DNA螺旋酶，參與同源重組，DNA復(fù)制和DNA修復(fù)(Cogoni and Macino,1997)。