本發(fā)明公開了一種衍生醛基嘧啶的方法、檢測5?醛基胞嘧啶的方法以及醛基嘧啶衍生物的應(yīng)用。本發(fā)明將醛基嘧啶與Wittig試劑于有機溶劑中混合，然后用紫外光進行輻射，制得醛基嘧啶衍生物；其中，醛基嘧啶為5?醛基胞嘧啶或5?醛基尿嘧啶。本發(fā)明反應(yīng)條件溫和、高效快速，有效拓展了Wittig試劑在表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，也為醛基嘧啶的化學(xué)標(biāo)記和反應(yīng)型5fC熒光探針的設(shè)計提供了新思路。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及核酸化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種衍生醛基嘧啶的方法、檢測5-醛基胞嘧啶的方法以及醛基嘧啶衍生物的應(yīng)用。

背景技術(shù)

哺乳動物細胞或組織DNA中，特別是CpG島，都存在著不同程度的甲基化修飾，這與胚胎發(fā)育，腫瘤、精神、血液系統(tǒng)等重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。DNA甲基化是指DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)以腺甲硫氨酸為甲基供體在胞嘧啶的5位碳上添加甲基使之轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶(5mC)的過程，并且此過程是動態(tài)可逆的，即DNA去甲基化。DNA去甲基化可分為主動和被動兩種不同的形式。前者是由于DNA甲基化維持機制受到抑制，例如 DNMT1失活，DNA甲基化水平在DNA的連續(xù)半保留復(fù)制過程中逐漸被稀釋；后者是指在TET等多種酶的參與下，5mC持續(xù)氧化并經(jīng)由一系列中間體最終轉(zhuǎn)化為胞嘧啶的過程。

5-醛基胞嘧啶(5fC)作為主動去甲基化過程的中間體，對于維持生命體正常的甲基化水平具有重要意義。2015年，有文獻報道稱通過監(jiān)測不同生長階段小鼠組織DNA中所有胞嘧啶衍生物的含量變化，首次提出5fC是一種穩(wěn)定的表觀遺傳學(xué)修飾，其豐度與其上游產(chǎn)物5-甲基胞嘧啶(5mC)、5- 羥甲基胞嘧啶(5hmC)及下游產(chǎn)物5-羧基胞嘧啶(5caC)沒有必然聯(lián)系。另有報道表明，與5hmC、5caC相比，5fC擁有更多的蛋白結(jié)合位點及更為獨特的堿基分布規(guī)律，使之在基因調(diào)控、改變DNA結(jié)構(gòu)、細胞分化及重大疾病等特殊生物事件中扮演著更為重要的角色。

在復(fù)雜的生理過程中要想更加深入地研究5fC的生理學(xué)功能，關(guān)鍵在于開發(fā)高選擇性、高靈敏度的檢測技術(shù)來準(zhǔn)確測定DNA中的5fC水平。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)因其自身特點在這方面具有顯著優(yōu)勢，但是5fC在體內(nèi)的豐度極低，離子化效率也低，再加上其他高含量經(jīng)典堿基或稀有堿基以及樣品基質(zhì)中各種各樣的雜質(zhì)干擾，使用LC-MS/MS技術(shù)準(zhǔn)確測定5fC仍然具有一定的挑戰(zhàn)性。

鑒于此，研究者們開始嘗試利用化學(xué)反應(yīng)將一些更為疏水的或易于離子化的基團共價修飾到5fC的骨架上去，從而改善5fC在液相分離時與諸多干擾項的分離分辨率，同時提高在質(zhì)譜檢測過程中的離子化效率。但是目前，針對5fC的活潑醛基，僅有酰肼和磺酰肼類衍生物涉及到此類應(yīng)用。但是，這種基于席夫堿反應(yīng)機理生成的C＝N雙鍵不夠穩(wěn)定，易于水解，這對本身就比較耗時的LC-MS/MS來說極為不利。

另外，相比于傳統(tǒng)的LC-MS/MS，熒光傳感技術(shù)擁有選擇性好、響應(yīng)時間短、操作簡單、可裸眼觀察等優(yōu)勢，先后被廣泛應(yīng)用于活細胞乃至動物體內(nèi)活性氧、活性硫、酶、核酸等生物靶標(biāo)的檢測。特別是有機小分子熒光探針因其具有易修飾、成本低等特點，受到了眾多科研工作者的青睞。近年來，著眼于5fC的C-5位醛基，相繼有報道稱其能被-NH2、-NHNH2、-ONH2、吲哚等衍生物熒光標(biāo)記。然而，5-醛基尿嘧啶(5fU)作為胸腺嘧啶(T)的氧化產(chǎn)物，與5fC的結(jié)構(gòu)極為類似，但其醛基的反應(yīng)活性遠勝于5fC，所以上述基于席夫堿反應(yīng)或Aldol縮合的熒光探針將優(yōu)先與5fU反應(yīng)。也就是說，這類試劑并不能區(qū)分這兩種醛基嘧啶，無法實現(xiàn)5fC的特異性熒光識別。