[發(fā)明專利]一種Tpl2缺陷型MDCK細胞株及其構建方法和應用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201910048190.7 | 申請日： | 2019-01-18 |
| 公開（公告）號： | CN111454908A | 公開（公告）日： | 2020-07-28 |
| 發(fā)明（設計）人： | 孟慶文;王偉;陳洪巖 | 申請（專利權）人： | 中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所(中國動物衛(wèi)生與流行病學中心哈爾濱分中心) |
| 主分類號： | C12N5/10 | 分類號： | C12N5/10;C12N15/85;C12N7/00 |
| 代理公司： | 北京高沃律師事務所 11569 | 代理人： | 劉奇 |
| 地址： | 150000 黑龍*** | 國省代碼： | 黑龍江;23 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 tpl2 缺陷 mdck 細胞株 及其 構建 方法 應用 | ||
1.一種Tpl2缺陷型MDCK細胞株，其特征在于，MDCK細胞株中Tpl2基因第1外顯子中第239位～第243位堿基缺失。
2.構建權利要求1所述Tpl2缺陷型MDCK細胞株的方法，包括以下步驟：
(1)將向導引物上下游引物序列單鏈混合后退火形成雙鏈，得到向導引物雙鏈；
所述向導引物的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)以BbsⅠ酶且pUC19質粒，得到線性化pUC19質粒；.
(3)將線性化pUC19質粒與向導引物雙鏈連接，得到pUC19-sgRNA質粒載體；
(4)以pUC19-sgRNA和pCas9-EGFP共轉染MDCK細胞，36～48h后分選表達EGFP的單個細胞進行培養(yǎng)7d，以靶位點鑒定引物篩選堿基數缺失的轉染后MDCK細胞，即得Tpl2缺陷型MDCK細胞株；
所述靶位點鑒定引物的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ IDNO.4所示。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述退火形成雙鏈的PCR反應程序為：37℃30min，95℃5min，1℃/s的速率降溫至25℃。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述連接的反應體系以每10μL總體系計，包括以下試劑：
100ng/μL的線性化pUC19-sgRNA質粒1μL、0.1μM的向導引物雙鏈1μL、T4 DNA連接酶1μL、10x連接酶Buffer 1μL和余量的水。
5.根據權利要求2或4所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述連接的反應溫度為4℃，連接的反應時間為10～16h。
6.權利要求1所述Tpl2缺陷型MDCK細胞株或權利要求2～5任意一項所述方法制備得到的Tpl2缺陷型MDCK細胞株在提高流感病毒產率中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述流感病毒為禽流感病毒。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述禽流感病毒為H5N1亞型禽流感病毒。
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