[發(fā)明專利]一種基于基因型選擇的比利時(shí)毛色家兔純化方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201910029901.6 | 申請(qǐng)日: | 2019-01-11 |
| 公開(公告)號(hào): | CN109680075B | 公開(公告)日: | 2020-12-04 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人: | 樊新忠;喬西波;惠春暉;王波;楊愛國;胡家卿;李明勇 | 申請(qǐng)(專利權(quán))人: | 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 主分類號(hào): | C12Q1/6888 | 分類號(hào): | C12Q1/6888 |
| 代理公司: | 北京細(xì)軟智谷知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11471 | 代理人: | 張肖 |
| 地址: | 271000 *** | 國省代碼: | 山東;37 |
| 權(quán)利要求書: | 查看更多 | 說明書: | 查看更多 |
| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 一種 基于 基因型 選擇 比利時(shí) 毛色 家兔 純化 方法 | ||
1.一種基于基因型選擇的比利時(shí)毛色家兔純化方法,其特征在于,所述純化方法包括以下步驟:
(1)提取待鑒定家兔的基因組DNA,分別使用第一引物組、第二引物組和第三引物組進(jìn)行擴(kuò)增,得到擴(kuò)增產(chǎn)物;
(2)根據(jù)步驟(1)得到的所述擴(kuò)增產(chǎn)物,鑒別待鑒定家兔的基因型,篩選得到表型為比利時(shí)毛色的純合型家兔,所述篩選得到的純合比利時(shí)毛色家兔基因型為AAEECC;
步驟(1)中,所述待鑒定家兔為肉兔、獺兔、長毛兔或觀賞兔類型中的任一種;所述待鑒定家兔毛色表型為比利時(shí)毛色;
所述第一引物組的正向引物為5’-AAGAAAGCAGGAAGGCACA-3’,反向引物為5’-CAAGGCAGGATTGGCTCA-3’;所述第二引物組的正向引物為5’-ACCTGCTGGTGAGCGTGA-3’,反向引物為5’-GTAGCGCAGTGCGTAGAAGA-3’;所述第三引物組的正向引物為5’-AAGACAAGGTGAAAGG-3’,反向引物為5’-TAAATCCAATAGGCAC-3’;
使用所述第一引物組擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)增體系為:總體積為20μL,包括Tris-HCL33.5mM、MgCl225mM、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各5ng/μl、Taq DNA聚合酶2.5U和模版DNA 50ng;擴(kuò)增程序?yàn)椋涸?4℃溫度下預(yù)變性5min;然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán),其中每個(gè)循環(huán)依次包括以下步驟:在94℃溫度下變性45s,在52℃下退火45s,在72℃溫度下延伸30s;完成30個(gè)循環(huán)之后,在72℃延伸5min,即完成PCR擴(kuò)增程序并在4℃下保存;使用所述第二引物組擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)增體系為:總體積為20μL,包括Tris-HCL33.5mM、(NH4)2SO4 8.0mM、MgCl2 1.5mM、TWEEN-200.05%、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各3.3ng/μl、Taq DNA聚合酶2.0U和模版DNA50ng;擴(kuò)增程序?yàn)椋涸?4℃溫度下預(yù)變性2min;然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán),其中每個(gè)循環(huán)依次包括以下步驟:在94℃溫度下變性45s,在62℃下退火45s,在72℃溫度下延伸60s;完成30個(gè)循環(huán)之后,在72℃延伸8min,即完成PCR擴(kuò)增程序并在4℃下保存;使用所述第三引物組擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)增體系為:總體積為20μL,包括Tris-HCL33.5mM、MgCl225mM、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各5ng/μl、Taq DNA聚合酶2.5U和模版DNA 50ng;擴(kuò)增程序?yàn)椋涸?4℃溫度下預(yù)變性5min;然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán),其中每個(gè)循環(huán)依次包括以下步驟:在94℃溫度下變性45s,在52℃下退火45s,在72℃溫度下延伸30s;完成30個(gè)循環(huán)之后,在72℃延伸5min,即完成PCR擴(kuò)增程序并在4℃下保存;
步驟(2)中,鑒別的方法為:對(duì)使用所述第一引物組得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序,檢測ASIP基因第二外顯子的第5位點(diǎn)和第6位點(diǎn)間插入堿基“A”時(shí),記為a基因型,未插入堿基“A”時(shí),記為A基因型;
對(duì)使用所述第二引物組得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序,檢測MC1R基因第280-285位點(diǎn)的堿基無缺失且304-333位點(diǎn)的堿基缺失30bp,記為E基因型;
對(duì)使用所述第三引物組得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序,檢測TYR基因第四外顯子的第1119位點(diǎn)的堿基類型,當(dāng)堿基為“C”時(shí),未發(fā)生基因突變,記為C基因型,當(dāng)堿基為“A”時(shí),發(fā)生基因突變,記為c基因型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法,其特征在于,篩選得到的純合比利時(shí)毛色家兔在育種中應(yīng)用。
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