本發(fā)明公開(kāi)了過(guò)表達(dá)AANAT基因在用于提升萊茵衣藻抗鹽能力的用途。AANAT過(guò)表達(dá)的萊茵衣藻工程藻，在鹽脅迫條件下，可以幫助提高藻細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)的酶活及降低膜損傷，以此來(lái)應(yīng)對(duì)的不良的外界脅迫，提高萊茵衣藻的自我防護(hù)能力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及過(guò)表達(dá)AANAT基因在提高萊茵衣藻抗鹽能力中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

鹽脅迫是世界上導(dǎo)致作物生產(chǎn)力下降的主要農(nóng)業(yè)問(wèn)題之一。鹽脅迫通過(guò)過(guò)多的鈉離子對(duì)植物造成脫水和滲透脅迫傷害從而影響植物的正常生長(zhǎng)和發(fā)育，為應(yīng)對(duì)鹽脅迫對(duì)植物造成的離子毒害和滲透脅迫，植物演化出多種防御機(jī)制來(lái)保護(hù)自己。其中，氧化應(yīng)激是植物早期快速響應(yīng)鹽脅迫的機(jī)制之一，此過(guò)程形成的活性氧(ROS)包括：超氧陰離子、過(guò)氧化氫和羥基自由基等。而且，ROS作為強(qiáng)氧化劑，高濃度的ROS可以通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化破壞膜，破壞DNA鏈并使各種重要的酶失活。植物為了應(yīng)對(duì)ROS的傷害，形成了一套由抗氧化酶和非抗氧化酶組成的抗氧化體系。抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)等，植物通過(guò)這些酶的作用清除或是減少ROS的積累，減輕和抵御鹽脅迫對(duì)植物細(xì)胞的傷害。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種過(guò)表達(dá)AANAT基因在提高萊茵衣藻抗鹽能力中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，過(guò)表達(dá)AANAT基因在用于提升萊茵衣藻抗鹽能力的用途。

進(jìn)一步地，采用玻璃珠轉(zhuǎn)化法將AANAT基因?qū)肴R茵衣藻的核基因組。

本發(fā)明還公開(kāi)了過(guò)表達(dá)AANAT基因用于促進(jìn)褪黑素在植物中過(guò)量表達(dá)的作用。

進(jìn)一步地，該植物為萊茵衣藻。

本發(fā)明過(guò)表達(dá)AANAT基因在提高萊茵衣藻抗鹽能力中的應(yīng)用，通過(guò)基因工程技術(shù)得到的AANAT過(guò)表達(dá)的萊茵衣藻工程藻，在鹽脅迫條件下，可以幫助提高藻細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)的酶活及降低膜損傷，以此來(lái)應(yīng)對(duì)的不良的外界脅迫，提高萊茵衣藻的自我防護(hù)能力。

附圖說(shuō)明

圖1萊茵衣藻核表達(dá)載體構(gòu)建流程圖；

圖2是PUCK-AANAT質(zhì)粒鑒定圖；

其中：APCR：M 15kb Marker，1-4pUCK-AANAT，5空白對(duì)照；

B Nde I、EcoR I雙酶切驗(yàn)證：M 10kb Marker，1空白對(duì)照，2-3 pUCK-AANAT；

圖3為pDBle-AANAT重組質(zhì)粒PCR驗(yàn)證及雙酶切驗(yàn)證圖；

其中：APCR：M 15kb Marker，1-8pDBle-AANAT，9陽(yáng)性對(duì)照，10空載體對(duì)照，11空白對(duì)照；

B Nde I、EcoR I雙酶切驗(yàn)證圖：M 15kb Marker，1空白對(duì)照，2-3 pDBle-AANAT；

圖4轉(zhuǎn)化藻株在Ble抗性TAP平板上的培養(yǎng)圖；

其中：A附加5.0μg/mL Ble TAP平板轉(zhuǎn)化衣藻繼代培養(yǎng)圖；

B附加10.0μg/mL Ble TAP平板轉(zhuǎn)化衣藻培養(yǎng)圖；

圖5為通過(guò)PCR分析對(duì)不同藻類(lèi)菌株中Ble基因的分子生物學(xué)分析：M為2kbMarker，1-8為轉(zhuǎn)化藻株，9為陽(yáng)性對(duì)照，10為空載體轉(zhuǎn)化萊茵衣藻，11為未轉(zhuǎn)化藻株，12是空白對(duì)照。

圖6通過(guò)定量實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)不同藻株中目的基因AANAT的相對(duì)表達(dá)量。NT是未轉(zhuǎn)化的衣藻；CK是空載體轉(zhuǎn)化的衣藻；T1，T2，T4，T5，T6和T8是轉(zhuǎn)化的衣藻屬菌株；誤差棒是三次測(cè)量的平均值(n＝3)±標(biāo)準(zhǔn)差。