本發明屬于慢病毒載體構建技術領域，具體涉及一種含有EGFP基因的慢病毒載體及其構建方法。所述慢病毒載體包括EGFP基因序列、慢病毒載體pLKO.1‐puro的基本序列、AgeI酶切位點、Eco RI酶切位點。所述制備方法為首先制備獲得EGFP基因，將EGFP基因亞克隆到pLKO.1‐Puro慢病毒載體上，制備獲得pLKO.1‐puro‐EGFP慢病毒載體。本發明構建獲得的pLKO.1‐puro‐EGFP慢病毒載體可以廣泛地應于到神經系統來源的細胞的實驗研究，以克服神經系統來源的細胞用化學轉染效率不高的問題。

技術領域

本發明屬于慢病毒載體構建技術領域，具體涉及一種含有EGFP基因的慢病毒載體及其構建方法。

背景技術

由于慢病毒的感染效率很高，對一些難于進行轉染的哺乳動物的細胞系來說，譬如原代培養的神經元來說，是一種十分有效的手段。神經系統來源的細胞系，如U87MG細胞，在通常的情況下，其化學轉染的效率不是很高，從而對有些實驗不能達到預期的目的，尤其是在基因水平上對目的基因的干預，不能收到預期的效果。電轉染的效果要比化學轉染好一些，但是實驗的條件要經過反復摸索，而且細胞的死亡，如同化學轉染一樣，是無法控制的，大部分的細胞在轉染/或電擊以后發生死亡，從根本上影響了實驗的進行。所以對于如神經系統來源的難轉染的細胞來說，病毒感染目前是一種效率比較高，而且操作簡便的方法。

在以病毒為載體對細胞進行感染，將外源性基因導入細胞內，以達到基因干擾，對靶基因進行操作方面，目前最常用的有腺病毒，逆轉錄病毒和慢病毒三種，但這三種病毒各有其利弊。早期使用的腺病毒系統，不能整合至靶細胞的基因組，只能瞬時表達，更為致命的是腺病毒的某些抗原表達，也很容易引起人體的免疫反應，所以在使用上有一定的局限性。反轉錄病毒載體是常用的病毒載體之一，是由具有感染性的小鼠的白血病病毒改造而來，能將非病毒基因導入細胞體內或體外進行有絲分裂。這些載體能產生病毒基因組的單一拷貝并高效準確地整和到宿主染色體的感染，但逆轉錄病毒只能感染分裂細胞，而且還存在有致癌的危險。相比之下，慢病毒(Lentivirus)載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎發展起來的基因治療載體，區別于一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。

慢病毒載體的研究發展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的基因治療效果，在國外已經開展了廣泛的臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應用前景的。

發明內容

針對上述技術問題，本發明提供一種含有EGFP基因的慢病毒載體及其制備方法。構建獲得的pLKO.1‐puro‐EGFP慢病毒載體可以廣泛地應于到神經系統來源的細胞的實驗研究，以克服神經系統來源的細胞用化學轉染效率不高的問題。該慢病毒載體含有EGFP熒光蛋白，可以更直觀地在熒光顯微鏡下觀察，使得未來的有關實驗更為簡便和直觀。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種含有EGFP基因的慢病毒載體，所述慢病毒載體包括EGFP基因序列、慢病毒載體pLKO.1‐puro的基本序列、AgeI酶切位點、Eco RI酶切位點。

進一步地，所述慢病毒載體還包括抗性基因，優選氨芐抗性基因；

一種含有EGFP基因的慢病毒載體的制備方法，首先制備獲得EGFP基因，將EGFP基因亞克隆到pLKO.1‐Puro慢病毒載體上，制備獲得pLKO.1‐puro‐EGFP慢病毒載體。

進一步地，通過對pEGFP‐C1載體進行雙酶切，制備獲得EGFP基因。

進一步地，EGFP基因的制備具體為：利用AgeI和Eco RI對pEGFP‐C1載體進行雙酶切，獲得EGFP基因。