[發(fā)明專利]一種復合口腔粘膜上皮細胞的口腔補片制備方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810450337.0 | 申請日： | 2018-05-11 |
| 公開（公告）號： | CN108498863A | 公開（公告）日： | 2018-09-07 |
| 發(fā)明（設計）人： | 李康樂;汪文濤;葛翠蘭 | 申請（專利權）人： | 上海白衣緣生物工程有限公司 |
| 主分類號： | A61L27/36 | 分類號： | A61L27/36;A61L27/38 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 201202 上海*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 口腔粘膜上皮細胞 口腔 補片 制備 復合 培養(yǎng)口腔粘膜 細胞培養(yǎng)皿 細胞培養(yǎng)箱 材料來源 傳代培養(yǎng) 口腔粘膜 上皮細胞 粘膜 缺損 下層 增殖 接種 修復 重建 | ||
1.一種復合口腔粘膜上皮細胞的口腔補片制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
1.1） 口腔補片的制備：采用粘膜下層制備口腔補片，步驟為取材于豬粘膜下層，經(jīng)去細胞、去DNA、病毒滅活、凍干和輻照滅菌等加工過程后獲得；
1.2） 口腔粘膜上皮細胞的原代培養(yǎng)：用Dispase II酶消化獲得手術病人口腔上皮層后，對其用消化酶消化，獲得一定密度口腔上皮細胞后進行培養(yǎng)；
1.3） 口腔粘膜上皮細胞的傳代培養(yǎng)：對步驟1.2中獲得口腔上皮細胞進行傳代培養(yǎng)至一定代數(shù)和密度；
1.4） 口腔粘膜上皮細胞與口腔補片復合培養(yǎng)：將步驟1.3中獲得的口腔上皮細胞接種在步驟1.1中的口腔補片上，培養(yǎng)至特定密度，即獲得復合口腔粘膜上皮細胞的口腔補片，可移植到口腔粘膜受損區(qū)，并縫合固定。
2.如權利要求1所述的口腔補片制備方法，其特征在于，粘膜下層為小腸粘膜、胃粘膜下層、膀胱粘膜下層的一種或多種。
3.如權利要求1所述的口腔補片制備方法，其特征在于，所述口腔粘膜上皮細胞的原代培養(yǎng)步驟為：無菌條件下于手術病人口腔內(nèi)獲取口腔黏膜組織；用含雙抗的生理鹽水反復沖洗，再用PBS液沖洗；用眼科剪除去黏膜下組織，剪成約5mm×5 mm的小塊，放入培養(yǎng)皿內(nèi)，加入含0.25％DispaseⅡ的DKSFM培養(yǎng)基并沒過組織塊， 4℃消化16～18h，將表層上皮與上皮下層用眼科鑷分開，上皮層加入消化酶37℃消化15min（5 min 吹打振動1次），加FBS液終止消化；
用吸管吹打成單細胞懸液；經(jīng)200目不銹鋼網(wǎng)過濾，離心，棄上清，PBS液清洗3次，經(jīng)細胞計數(shù)后，按每毫升1×105個細胞接種于細胞培養(yǎng)皿內(nèi)，加入培養(yǎng)液3～5ml，置37℃、5%CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3天開始首次換液，以后每2天換液1次。
4.如權利要求1所述的口腔補片制備方法，其特征在于，所述口腔粘膜上皮細胞的傳代培養(yǎng)步驟為：倒置相差顯微鏡下觀察，當口腔粘膜上皮細胞鋪滿培養(yǎng)皿底2/3以上時，棄掉舊培養(yǎng)液；4 ℃ PBS清洗 3次，加入消化酶37 ℃消化，倒置相差顯微鏡下見大部分細胞變圓脫壁后，加入培養(yǎng)液終止消化，用彎頭吸管反復吹打，形成細胞懸液，離心，棄上清；加入培養(yǎng)液重懸細胞，經(jīng)細胞計數(shù)后，按每毫升1×105個細胞接種新培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。
5.如權利要求1所述的口腔補片制備方法，其特征在于，所述口腔粘
膜上皮細胞與口腔補片復合培養(yǎng)步驟為：取步驟1.1中獲得的口腔補片，放入細胞培養(yǎng)皿中，用DKSFM培養(yǎng)基浸泡1～3天后，加入6～20%的牛血清，放入37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育12～16h；
取步驟1.3中傳代培養(yǎng)的口腔粘膜上皮細胞，用含 0.02％EDTA 的消化酶消化，離心、去上清，PBS反復漂洗3次后加入培養(yǎng)液制成細胞懸液，將細胞懸液稀釋后種至放有口腔補片的細胞培養(yǎng)皿中，放入37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～3天換液1次。
6.如權利要求3所述的口腔補片制備方法，其特征在于
所述消化酶溶液包括濃度為0.25%的胰蛋白酶溶液；
所述離心過程使用的轉(zhuǎn)速及時間優(yōu)選為800rpm，5min；
所述步驟1.2中的雙抗生理鹽水含有100ug/ml的青霉素與100ug/ml的鏈霉素；
所述步驟1.2中FBS液含有10%的FBS。
7.如權利要求3 - 5所述的口腔補片制備方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)液為6 ～2 0%FBS的DKSFM培養(yǎng)液。
8.如權利要求1或4所述的口腔補片制備方法，其特征在于，所述步
驟1.4中所述傳代培養(yǎng)獲得的口腔粘膜上皮細胞優(yōu)選為2代培養(yǎng)的細胞。
9.如權利要求4所述的口腔補片制備方法，其特征在于，所述步驟1.4中所述的細胞懸液的接種密度為2×106～5×106個/皿。
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