[發明專利]一種利用耳后皮膚培養成纖維細胞的方法在審
| 申請號： | 201810387827.0 | 申請日： | 2018-04-26 |
| 公開（公告）號： | CN110408585A | 公開（公告）日： | 2019-11-05 |
| 發明（設計）人： | 小威廉·K·博斯;孫中鋒;王新榮 | 申請（專利權）人： | 西安新長安再生醫學科技研發有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/071 | 分類號： | C12N5/071 |
| 代理公司： | 北京中原華和知識產權代理有限責任公司 11019 | 代理人： | 壽寧;張華輝 |
| 地址： | 710000 陜西省西安市高*** | 國省代碼： | 陜西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 成纖維細胞 皮膚培養 制備 細胞原代培養 組織工程產品 擴增培養 美容產品 皮膚組織 細胞純化 凍存 可用 酶解 采集 復蘇 檢測 | ||
1.一種利用耳后皮膚培養成纖維細胞的方法，包括以下步驟
(1)組織采集：無菌條件下取耳后皮膚組織，置入含DMEM培養液的培養皿中,組織樣本經兩次DMEM和磷酸鹽緩沖液離心清洗后，加入凍存液，冷凍保存；
(2)組織復蘇及酶解：取出凍存組織，經水浴鍋中快速解凍后用75％乙醇消毒1-3min；隨后用DMEM和磷酸鹽緩沖液清洗1-3次；清洗后的皮膚組織加入中性裂解酶過夜消化后，去除表皮，用無菌剪刀將真皮組織剪碎成小塊；
(3)原代培養：將步驟⑵中剪碎后的皮膚組織加入的成纖維細胞專用培養液，混勻后移至培養瓶內，在含有5％CO2，37℃的培養箱中培養10-15天；
(4)細胞純化：當步驟⑶中細胞融合度達到50％-90％時，用含有0.25％胰蛋白酶-EDTA消化后移至培養瓶中培養3-5天，當細胞融合度達到90％以上時，消化收獲細胞，此時為第一代細胞；將第一代細胞移至培養瓶中培養2-3天后，消化收獲細胞，此時為純的成纖維第二代細胞；
(5)成纖維細胞擴增培養：將第二代細胞接種到自動細胞擴增體系培養，每天檢測自動細胞擴增系統內培養液乳酸值，并用以計算擴增的理論數值,當細胞數值達理想狀態時消化收獲細胞，此為第三代成纖維細胞。
2.根據權利要求1所述的利用耳后皮膚培養成纖維細胞的方法，其特征在于,步驟(4)中收獲細胞時根據細胞形態的變化來判斷何時終止消化,當細胞收縮,漂起的時候立即加成纖維細胞專用培養液終止消化。
3.根據權利要求1所述的利用耳后皮膚培養成纖維細胞的方法，其特征在于,步驟(4)中收獲細胞時通過成纖維細胞專用培養液及限制消化時間來去除上皮細胞及角質細胞，以純化成纖維細胞。
4.根據權利要求1所述的利用耳后皮膚培養成纖維細胞的方法,其特征在于步驟(5)所述自動細胞擴增系統培養過程為:將第二代成纖維細胞的1-2×107個細胞轉移到自動細胞擴增系統中，在5％CO2、37℃條件下進行培養。
5.根據權利要求1所述的利用耳后皮膚培養成纖維細胞的方法,其特征在于步驟(5)所述自動細胞擴增系統培養過程中，在不同時間點抽取培養液檢測乳酸值，計算細胞擴增的理論數值，判斷系統內細胞的生長情況；當細胞生長處于指數生長期末端時，消化收獲細胞。
6.根據權利要求1所述的利用耳后皮膚培養成纖維細胞的方法,其特征在于步驟(5)所述自動細胞擴增系統培養過程中,根據載入的細胞數量，設置不同的參數:
a.1500萬＞細胞上樣量＞500萬時,設置25mL/min的進樣速度、150mL/min循環；
b.當細胞數量大于1500萬時,設置25mL/min的進樣速度、200mL/min循環。
7.根據權利要求6所述的利用耳后皮膚培養成纖維細胞的方法，其特征在于,
當適用a時,設置培養液進液速度為25mL/min，逆時針20mL/min循環3min；
當適用b時,設置培養液進液速度為0mL/min，逆時針200mL/min循環4min。
8.根據權利要求1所述的利用耳后皮膚培養成纖維細胞的方法,其特征在于:將(5)中獲得的成纖維細胞放入保存液中，分裝于凍存管中，將凍存管放入凍存裝置內，直接放入-86℃低溫冰箱內，次日移入液氮保存罐內；所述凍存裝置采用梯度降溫程序，平均降溫速率為-1℃/分鐘。
9.根據權利要求1所述的利用耳后皮膚培養成纖維細胞的方法,其特征在于所述的成纖維細胞為第三代細胞，第三代細胞產量為2×108-8×108個，第三代成纖維細胞的純度≥99％，第三代成纖維細胞的活性≥95％。
10.根據權利要求1所述的利用耳后皮膚培養成纖維細胞的方法,其特征在于步驟(1)中的耳后皮膚組織為完整的皮膚組織,包括表皮、真皮、皮下組織。
11.根據權利要求1所述的利用耳后皮膚培養成纖維細胞的方法,其特征在于還包括成纖維細胞檢測的步驟：抽取樣本進行細胞計數、細胞活力和安全性檢測，安全性檢測包括細菌和真菌、支原體、內毒素檢測。
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