本發明涉及一種定量檢測牛奶中β?內酰胺酶殘留的熒光微球檢測卡及其制備方法，具體步驟為：（1）抗β?內酰胺酶配對單克隆抗體的制備，包括免疫程序、細胞融合、雜交瘤篩選及克隆化、抗體制備及純化；（2）β?內酰胺酶殘留的熒光微球定量檢測檢測卡及其制備方法，包括熒光微球抗β?內酰胺酶單克隆抗體的制備、微球墊處理、噴膜、C，T線確定、性能測定。本發明檢測牛奶中β?內酰胺酶殘留的最低檢測限為1×10^?6U/mL(U/g)，并且牛奶樣本直接檢測，無需任何樣本處理過程，可以快速、靈敏、準確的定量檢測牛奶中β?內酰胺酶殘留。

技術領域

本發明屬于生物技術領域以及食品安全定量檢測技術領域，具體涉及一種半定量快速定量檢測牛奶中β-內酰胺酶殘留的熒光微球定量檢測檢測卡及其制備方法。

背景技術

β-內酰胺酶（β-lactamase）是細菌產生的可水解β-內酰胺環抗生素的酶。β-內酰胺酶的產生是細菌對(β-內酰胺類)抗菌藥物耐藥最常見的機制，廣泛地涉及到許多社區獲得性感染和醫院內感染的重要病原菌，在各種耐藥機制中占80%。β-內酰胺酶因可以分解牛奶中殘留的β-內酰胺類抗生素，掩蓋抗生素痕跡，故被列入《食品中可能違法添加的非食用物質》名單，中國不允許在牛奶中添加。

目前，定量檢測牛奶中β-內酰胺酶的方法，包括微生物法、碘量法、頭孢菌素顯色法、酸度法和高效液相色譜法。液相色譜-串聯質譜(RRLC-MS/MS)定量檢測方法利用活性β-內酰胺酶能夠酶解青霉素族藥物的特性，在原乳中加入適量氨芐青霉素，酶解1h后，定量檢測原乳中氨芐青霉素酶解率，定性定量檢測活性目標物。試樣中氨芐青霉素經乙腈溶液提取，HLB固相萃取柱凈化和濃縮后，RRLC-MS/MS多反應監測模式定性與定量分析，該方法對活性β-內酰胺酶檢出限為4U/mL。牛奶中β-內酰胺酶殘留的檢測方法改進有Charm試劑盒，結果顯示，β-內酰胺酶在快速檢測法中的最低檢出限為1.5×10^-4～1.6×10^-3U/mL(U/mL)。發明專利申請CN201310001684.2公開了一種檢測牛奶中β-內酰胺酶的雙抗體夾心法，應用重組β-內酰胺酶免疫8周齡的BALB/c小鼠，經過正常的免疫、細胞融合、篩選后得到15株β-內酰胺酶單克隆抗體，15株單克隆抗體分別標記辣根過氧化物酶（HRP）并進行兩兩配對，以JN2011-03、JN2011-04分別為包被抗體和酶標抗體，以β-內酰胺酶為標準品建立了β-內酰胺酶的夾心ELISA分析方法，LOD為1.22ng/mL，線性范圍為10-100ng/mL。發明專利CN201310293739.1公開了一種定量檢測牛奶中β-內酰胺酶殘留的試劑盒，包含包被有青霉素結合蛋白的酶標板、標記物偶聯β-內酰胺類抗生素、底物對照1為β-內酰胺類抗生素濃度為0ppb的脫脂奶粉凍干品、底物對照2為含標定濃度β-內酰胺類抗生素的脫脂奶粉凍干品、β-內酰胺類抗生素標準品，所述試劑盒具有良好的特異性和靈敏性，可檢出大約0.5U/ml濃度的β-內酰胺酶，線性檢出范圍為1U/ml～16U/ml。發明專利申請CN201110162413.6公開了一種用于檢測原料乳及乳制品中β-內酰胺酶的檢測裝置及其檢測方法，包括檢測試紙條、標準比色卡；標準比色卡由9個色塊組成，從淺到深分別對應于0U/mL、6U/mL、12U/mL、25U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL的β-內酰胺酶濃度；檢測試紙條由過濾層、顯色層、吸水材料層和基板組成，以2,2'-聯喹啉乙醇溶液作為顯色劑和CuSO₄作為絡合劑制備而成，根據待測樣品顯色程度與標準比色卡的對比，快速判定β-內酰胺酶的含量范圍。

以上定量檢測方式均存在檢測時間長，有的需要大型儀器輔助測試，檢測費用高等缺點。本研究利用免疫微球定量檢測原理，研制出一種新型的快速定量檢測牛奶中β-內酰胺酶殘留的熒光微球檢測卡及其制備方法，為快速、靈敏、準確的定量檢測牛奶中β-內酰胺酶殘留減少了時間和成本。

發明內容

本發明提供了一種定量檢測牛奶中β-內酰胺酶殘留的檢測卡及其制備方法，本發明為快速、靈敏、準確的定量檢測牛奶中β-內酰胺酶殘留減少了時間和成本，并提升了靈敏度。