本發明涉及產腸毒素大腸桿菌I型菌毛基因的應用。本發明公開了fimA序列中第71位的一段特有基序AAACTA作為監測、鑒別產腸毒素大腸桿菌的分子標記的應用。并設計一對特異性鑒定引物，可以在豬場臨床環境中快速檢測產腸毒素大腸桿菌。通過這對引物對分離的細菌DNA模板進行PCR擴增，如果存在產腸毒素大腸桿菌，則可以擴增預期的陽性條帶；如果是其他非產腸毒素大腸桿菌病原菌，非致病大腸桿菌或引起腹瀉的其他病原菌如沙門菌、魏氏梭菌等其他菌屬，則結果陰性。本發明基于不同菌屬I型菌毛FimA基因序列的差異性，發現在產腸毒素大腸桿菌fimA存在的特有的一段序列，設計出為臨床快速區分和鑒定產腸毒素大腸桿菌提供新策略和方法。

技術領域

本發明涉及生物技術領域。主要是用產腸毒素大腸桿菌fimA基因的獨特序列位點作為分子標記，利用該序列設計一對特異性的引物，通過常規PCR擴增特征性基因片段進行檢測。

背景技術

仔豬腹瀉是生豬生產中最常發的疾病，導致仔豬日增重減少，脫水甚至死亡，對正常生產造成嚴重的影響。引起仔豬腹瀉最常見的病原體包括產腸毒素大腸桿菌(ETEC)，沙門菌，魏氏梭菌等細菌，以及豬傳染病胃腸炎病毒(TGEV)，豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和豬輪狀病毒(RV)等病毒。其中病原菌產腸毒素大腸桿菌根據其表達的菌毛類型可以進一步分類為K88⁺ETEC，F18⁺ETEC，987P⁺ETEC，F41⁺ETEC，K99⁺ETEC等不同血清型。目前臨床上對豬場新發仔豬腹瀉疾病的診斷主要是：(方法1)通過不同病原體的抗(體)血清進行玻板或者試管凝集實驗確認陽性。因此，在確定細菌引發的腹瀉時，需要使用針對不同大腸桿菌K88，K99，F18，987P，F41菌毛抗血清，不同沙門菌鞭毛或O抗原單因子抗血清，以及魏氏梭菌鑒定方法分別進行檢測，直到獲得陽性反應結果，上述凝集反應的敏感性不高，特異性也存在有一定程度局限性，常常存在假陽性；(方法2)通過實驗室對腸道、糞便樣品進行培養和劃線分離，通過生化試驗確定菌屬后(通常培養需要一天)，再通過血清凝集或者針對不同抗原血清型的引物進行PCR確定具體病原菌血清型，過程繁瑣，耗時耗力。值得注意的是，在鑒定過程中，標準株和臨床分離株通常都需要篩選特殊的培養基并需要在實驗室連續培養傳代并在適宜的環境下(如溫度、pH值等)，其用于血清學檢查的外膜抗原表達較為充分，而未經上述方法處理的菌株其粘附素在體外培養條件下不能達到一定程度的表達，因而采用單因子血清進行玻板或試管凝集試驗檢測，不能產生肉眼可見的凝集反應，基于檢測菌毛的玻板或試管凝集試驗和應用受到很大限制。

發明內容

本發明的目的在于提供一種快速、簡便、特異性強、適合臨床使用的PCR特異性檢測方法，可以對臨床環境樣本進行快速鑒別是否為產腸毒素大腸桿菌。

本發明的技術方案：從已知的基因序列信息和比較分析表明，產腸毒素大腸桿菌的fimA序列較其他菌屬相對保守，并且豬源產腸毒素大腸桿菌的fimA序列較非致病性大腸桿菌或其他致病性大腸桿菌在其第71個堿基處存在特有的6個堿基(連續插入“AAACTA”)。鑒于基因fimA以上特征，在大腸桿菌基因fimA設計上下游引物，其中上游引物3’端序列為AAACTA。根據PCR原理，引物3’端如果不能有效配對模板序列，則不能發生有效匹配擴增。該設計上游引物末端序列僅在豬產腸毒素大腸桿菌fimA序列71個堿基處出現，其他血清型大腸桿菌或其他菌屬fimA基因均不存在。因此，通過制備各種待檢細菌的DNA模板用于PCR檢測，當模板可以特異性擴增預期294bp大小的條帶時，說明并明確該待檢菌株為產腸毒素大腸桿菌；當模板不能擴增相應條帶，則該待檢菌株不是產腸毒素大腸桿菌。

本發明公開了I型菌毛fimA基因第71位插入特征序列“AAACTA”作為監測、鑒別產腸毒素大腸桿菌的分子標記的應用。

本發明還公開了用于檢測仔豬腹瀉致病性大腸桿菌的特異性引物，其特征是一段引物的3’端末端序列為AAACTA，一個具體的實例，序列如下：