本發明公開了一種降鈣素原突變體，該降鈣素原突變體具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，或者該降鈣素原突變體具有將SEQ ID No:1所述的氨基酸序列經過一個或者幾個氨基酸殘基的取代、缺失或者添加后仍具有降鈣素原突變體的穩定性的氨基酸序列；其中所述降鈣素原突變體片段結構為降鈣素原氨基多肽?連接臂1?降鈣素?連接臂2?降鈣蛋白，所述連接臂1為?Ala?Gly?，所述連接臂2為?Ala?Gly?Ala?Gly?。本發明還公開了該降鈣素原突變體的制備方法和用途。本發明通過對天然降鈣素原蛋白中的2個水解位點58?59aa和92?95aa進行替換，得到了一種降鈣素原突變體，提高了降鈣素原體外穩定性。同時本發明采用柔性連接臂替換上述水解位點，使獲得的降鈣素原突變體保留天然降鈣素原蛋白的抗原性。

技術領域

本發明屬于基因工程和蛋白質改造技術領域，具體涉及一種降鈣素原突變體及其制備方法和用途。

背景技術

降鈣素原(procalcitonin，PCT)是一個小分子蛋白，含有116個氨基酸殘基，分子量為大約13kDa。降鈣素通常由甲狀腺C細胞產生，經過連續的裂解后行成3個分子：N端部分(N端PCT，57個氨基酸殘基)、降鈣素(32個氨基酸殘基)和抗鈣素(21個氨基酸殘基)。血清中PCT水平可以作為鑒定細菌感染程度和抗生素指導使用的臨床指標，在提示細菌感染及其感染程度、判斷治療效果、指導抗菌藥物治療等方面發揮了重要的作用。

目前用于檢測PCT的方法有酶免法、免疫化學發光法、放射免疫法等，這些方法中都需要用到不同濃度的重組的PCT抗原作為標準品，制作標準曲線，從而計算樣品中PCT的含量，然而目前重組PCT在體外極不穩定，容易降解，極大地影響臨床PCT標準品的穩定性及樣本檢測結果的準確性。現有研究顯示PCT在高爾基體中，經系列水解酶作用最終可形成PCT氨基多肽(1-57aa)、降鈣素(60-91aa)及降鈣蛋白(96-116aa)。由此推斷出看出58-59aa和92-95aa為水解位點，這些水解酶位點的存在極可能是導致PCT參考品不穩定的重要因素。

發明內容

本發明的目的在于對天然降鈣素原蛋白進行改造，在保持原有天然降鈣素原活性的同時，使改造后的降鈣素原蛋白突變體在穩定性方面有顯著提高。

本發明提供了一種降鈣素原突變體，該降鈣素原突變體具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，或者該降鈣素原突變體具有將SEQ ID No:1所述的氨基酸序列經過一個或者幾個氨基酸殘基的取代、缺失或者添加后仍具有降鈣素原突變體的穩定性的氨基酸序列；其中所述降鈣素原突變體片段結構為降鈣素原氨基多肽-連接臂1-降鈣素-連接臂2-降鈣蛋白，所述連接臂1為-Ala-Gly-，所述連接臂2為-Ala-Gly-Ala-Gly-。

在一個優選實施例中，所述降鈣素原突變體具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。

本發明另一方面提供了一種編碼降鈣素原突變體的基因，所述基因具有SEQ IDNo:2所示的核苷酸序列，或者所述基因具有編碼SEQ ID No:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

在一個優選實施例中，所述基因具有SEQ ID No:2所示的核苷酸序列。

本發明另一方面提供了一種重組載體，所述重組載體含有如權利要求3所述的基因。

本發明還提供了一種降鈣素原突變體的制備方法，包括以下步驟：

a.降鈣素原突變體氨基酸序列的設計：采用連接臂1-Ala-Gly-和連接臂2-Ala-Gly-Ala-Gly-分別替換天然降鈣素原蛋白位于58-59aa序列-Lys-Arg-和位于92-95aa序列-Gly-Lys-Lys-Arg-，獲得序列SEQ ID No:1；