本發明涉及一種敲除膠質母細胞瘤細胞DHC2基因的試劑盒，以及該試劑盒的應用，以及一種敲除膠質母細胞瘤細胞的DHC2等位基因的方法。本發明所述的敲除膠質母細胞瘤DHC2基因的試劑盒，包括第一敲除質粒和第二敲除質粒，或者包括第一敲除質粒和第三敲除質粒，或者包括第一敲除質粒、第二敲除質粒和第三敲除質粒；所述第一敲除質粒能轉錄出序列為SEQ ID NO:1的第一向導RNA；所述第二敲除質粒能轉錄出序列為SEQ ID NO:2的第二向導RNA；所述第三敲除質粒能轉錄出序列為SEQ ID NO:3的第三向導RNA。本發明首次提供了針對DHC2基因進行穩定敲除的試劑盒，本試劑盒所包含的敲除質粒具備脫靶率低、特異性強的特征；該試劑盒能穩定敲除DHC2兩等位基因，基因編輯效率極高。

技術領域

本發明涉及一種敲除膠質母細胞瘤細胞DHC2基因的試劑盒，以及該試劑盒的應用，以及一種敲除膠質母細胞瘤細胞的DHC2等位基因的方法。

背景技術

膠質瘤是最常見的原發性惡性腦腫瘤，而所有組織類型的膠質瘤中，又以膠質母細胞瘤(Glioblastoma,GBM)最為常見、惡性程度最高、預后最差，其中位無進展生存期僅為6.9個月，中位總體生存期僅為14.6個月。盡管膠質瘤研究在基因分析水平取得了巨大進步，分子靶向藥物、免疫療法等在GBM治療中尚無明顯進展。目前國際上治療膠質瘤依然主要采用最大安全范圍的手術全切除，術后輔以規范的同步放化療，替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)為首選化療藥物。然而，GBM會對TMZ產生治療抵抗，這是治療GBM面臨的最大困難。GBM對TMZ耐藥，最為重要的是O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉移酶(MGMT)介導的DNA修復；此外，許多其他DNA損傷修復途徑通過協同作用，修復損傷DNA雙鏈，亦可以導致GBM對TMZ產生抵抗。臨床上，有近半數的GBM為MGMT表達陰性，仍會產生誘導性耐藥，具體機制尚不清楚。因此，GBM對于TMZ治療抵抗的具體機制亟待揭示。

DHC2(又名DYNC2H1；dynein cytoplasmic 2heavy chain 1)是胞漿動力蛋白的一條重鏈，一端與貨物結合，另一端則可沿著微管運動，將貨物逆轉運細胞核內。本發明人的前期研究發現，DHC2蛋白可以通過逆轉運多種DNA損傷修復蛋白進入細胞核，從而導致MGMT陰性GBM發生誘導耐藥；這就提示：如果干預DHC2逆轉運途徑，將同時阻斷多種DNA損傷修復途徑，達到滿意的治療效果(Wang H,Feng W,Lu Y,Li H,Xiang W,Chen Z,He M,Zhao L,Sun X,Lei B,Qi S,Liu Y.Expression of dynein,cytoplasmic 2,heavy chain 1(DHC2)associated with glioblastoma cell resistance to temozolomide.Sci Rep.20164；6:28948.)。